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1. Preparación de biofilm in vitro
- Obtener colonias aisladas de S. aureus a partir de una cepa criopreservada utilizando una técnica de placa de rayas en una placa de agar rica en nutrientes, como el agar de soja tríptico (ver Tabla de Materiales).
- Cubra los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos con 100 μL de poli-L-lisina (PLL) al 0,001% (v/v) diluido en H2O estéril e incube a temperatura ambiente durante 30 min. Asépticamente, aspire la solución de PLL utilizando una trampa de aspiración asistida por vacío. Deje que los pozos se sequen durante la noche a temperatura ambiente.
nota: Todos los pasos de aspiración del protocolo se realizan utilizando una trampa de aspiración asistida por vacío, a menos que se indique lo contrario.
- Preparar un cultivo nocturno inoculando una colonia de S. aureus en medio esencial mínimo alfa (MEMα) suplementado con glucosa al 2% e incubar a 37 °C, agitando a 200 rpm durante 16-18 h.
- Diluir el cultivo durante la noche transfiriendo 50 μL a 5 mL de MEMα fresco suplementado con glucosa al 2% e incubar a 37 °C, agitando a 200 rpm, hasta la fase logarítmica media, generalmente entre una densidad óptica de 600 (DE600nm) de 0,5-0,8. Utilice MEMα para normalizar el cultivo logarítmico medio a un diámetro exterior de600nm de 0,1.
- Transfiera 150 μL de cultivo normalizado a cada pocillo de la placa de 96 pocillos tratada con PLL. Incubar estáticamente durante 18-20 h en una cámara humidificada a 37 °C.
nota: Las biopelículas también se pueden cultivar en otros formatos, como portaobjetos de μ canales (ver Tabla de Materiales).
- Aspirar el sobrenadante para eliminar las células planctónicas. Lave suavemente la biomasa restante con 150 μL de solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks para eliminar las células sueltas. Agregue HBSS gota a gota para evitar alterar la biopelícula.
nota: Mientras aspira el sobrenadante y el HBSS durante los lavados, deje solo suficiente líquido (sobrenadante o HBSS) en los pocillos que contienen biopelícula para que la biopelícula aún esté sumergida. Esto evita la interrupción de la estructura de la biopelícula cuando se agrega HBSS gota a gota para lavar la biopelícula.
- Repita el paso 1.6 al menos dos veces más para eliminar todas las células planctónicas. En este punto, las biopelículas están listas para experimentos posteriores inmediatos.
nota: Si las biopelículas no se utilizan para experimentos con neutrófilos, el HBSS puede sustituirse por solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se prefiere el HBSS al PBS, ya que el HBSS contiene componentes, incluida la glucosa, que proporcionan las condiciones óptimas para la activación de los neutrófilos.
>2. Aislamiento de neutrófilos
NOTA: Los neutrófilos se aislaron siguiendo un método previamente publicado con cambios menores. Este protocolo de aislamiento combina primero la centrifugación en gradiente de densidad, seguida de la sedimentación de dextrano al 3%. Esta sección solo cubre el protocolo general de aislamiento de neutrófilos, centrándose en los cambios realizados en el protocolo publicado. Además, el protocolo que se describe a continuación es uno de los muchos métodos que pueden aislar neutrófilos y se pueden sustituir según sea necesario. Otros métodos para aislar neutrófilos incluyen el uso de medios de separación celular o separación celular de anticuerpos magnéticos.
- Extracción de sangre de un donante adulto mediante venopunción, según el protocolo descrito en el IRB institucional. Antes de la extracción de sangre, asegúrese de que la jeringa tenga suficiente heparina sin conservantes, de modo que la concentración final de heparina sea de 20 U/mL.
- Diluir la sangre heparinizada con 3/4 del volumen de NaCl al 0,9% libre de endotoxinas (ver Tabla de Materiales) enH2O a temperatura ambiente.
- Por cada 20 mL de la muestra de sangre diluida, alícuota 14 mL de un medio de gradiente de densidad disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales) en un tubo cónico nuevo de 50 mL. Coloque cuidadosamente la muestra de sangre diluida sobre el medio de gradiente de densidad.
- Centrifugar la muestra de sangre en capas a 400 x g durante 40 minutos a temperatura ambiente. Asegúrese de que la centrífuga tenga una pausa lenta para evitar perturbar la capa una vez que se complete la centrifugación.
nota: La muestra de sangre tendrá cinco capas que contendrán una mezcla de solución salina y plasma, una capa de células mononucleares, un medio de gradiente de densidad, neutrófilos y eritrocitos.
- Con una pipeta serológica, aspire todas las capas por encima de los neutrófilos y el pellet de eritrocitos, seguido de una resuspensión suave del pellet en NaCl al 0,9% libre de endotoxinas en H2O. Por cada gránulo generado a partir de una muestra de sangre de 20 mL, vuelva a suspender el gránulo hasta un volumen total de 20 mL. Añadir volumen 1:1 de dextrano al 3% (ver Tabla de Materiales). Incubar el tubo en posición vertical durante 18-20 min en hielo.
nota: Asegúrese de que el dextrano al 3% esté hecho con NaCl al 0,9% libre de endotoxinas enH2O.
- Retirar 20 mL de la capa superior que contiene neutrófilos y algunos eritrocitos en un nuevo tubo cónico de 50 mL y centrifugarlo a 355 x g durante 10 min a 4 °C. Vierta el sobrenadante dejando una bolita roja.
- Vuelva a suspender suavemente el pellet en 10 mL deH2O frío y estéril durante 30 segundos para lisar los eritrocitos restantes. Añadir inmediatamente 10 mL de solución salina fría al 0,9% libre de endotoxinas a la mezcla para restaurar la tonicidad. Centrifugar la solución a 233 x g durante 3 min a 4 °C.
- Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet que contiene 95%-97% de neutrófilos en 1 mL de HBSS frío por 20 mL de la muestra de sangre.
- Transfiera 10 μL de los neutrófilos resuspendidos en 90 μL de colorante de exclusión azul de tripano al 0,4% y cuente las células con un hemocitómetro (ver Tabla de Materiales).
nota: Las células no viables se tiñen de azul, ya que el tinte de exclusión azul de tripano es impermeable en las células viables. Este protocolo proporciona una viabilidad celular del >99%.
- Agregue HBSS adicional de tal manera que la concentración final de neutrófilos sea de 4 x 106 células/mL.
nota: Para los casos con una viabilidad celular del <99%, aún se puede lograr la concentración final de 4 x 106 células/mL; sin embargo, el volumen total de solución que contiene 4 x 106 células/mL obtenido disminuirá. La concentración final de neutrófilos se puede ajustar de acuerdo con las necesidades experimentales del usuario. Los neutrófilos se resuspendieron a una concentración final de 4 x 106 células/mL para todos los experimentos descritos a continuación. Para tener en cuenta la variabilidad de un donante a otro, se recomienda encarecidamente que todos los experimentos relacionados con neutrófilos se realicen con al menos tres donantes diferentes.
>3. Imágenes de las interacciones biopelícula-neutrófilos
- Configure una biopelícula siguiendo los pasos 1.2-1.6. Para facilitar la obtención de imágenes de biopelícula, emplee una cepa fluorescente de S. aureus, como USA300 que expresa proteína verde fluorescente (GFP), para aumentar la facilidad de las imágenes de microscopía.
nota: Se utilizó un portaobjetos de 6 μ canales (ver Tabla de Materiales) en lugar de una placa de 96 pocillos para demostrar el modelo de biopelícula in vitro (paso 1).
- Incubar 4 x 106 células/mL de neutrófilos con 100 μM de colorante azul CMAC (7-amino-4-clorometilcumarina) (BCD, ver Tabla de Materiales) durante 30 min en un balancín a 37 °C y 5% de CO2. Asegúrese de que las muestras se incuben en la oscuridad y limite la exposición a la luz durante los pasos restantes.
- Para lavar el exceso de BCD, centrifugar los neutrófilos a 270 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender los neutrófilos en HBSS frescos. En este punto, agregue homodímero-1 de etidio (consulte la tabla de materiales) a los neutrófilos teñidos con BCD a una concentración final de 4 μM para monitorear la muerte de neutrófilos y bacterias.
- Agregue 150 μL de neutrófilos a la biopelícula de S. aureus que se ha cultivado en portaobjetos de μ, de modo que la proporción de neutrófilos a bacterias sea de 1:30 (neutrófilos: bacterias). Incubar los portaobjetos de μ en una cámara humidificada durante 30 min. El número de células bacterianas se basa en los recuentos de células obtenidos de la siembra de una biopelícula de 18 h.
- Imagen de la interacción neutrófilo-biopelícula utilizando canales fluorescentes correspondientes a las longitudes de onda de excitación y emisión de los colorantes/proteínas fluorescentes.
nota: Para el presente estudio, el BCD es de 353/466 nm, el homodímero-1 de etidio es de 528/617 nm y el GFP es de 395/509 nm. Limite la exposición de la muestra al láser o a la luz para evitar el fotoblanqueo de las muestras.
- Analice las imágenes utilizando software de análisis de imágenes de microscopía o programas como FIJI / ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ y BAIT, entre muchos más.
nota: Al trabajar con tintes, es importante tener en cuenta la especificidad de los tintes utilizados. Algunas tinciones funcionan en las células procariotas y eucariotas, mientras que otras funcionan solo en una. Si los neutrófilos y las biopelículas se tiñen por separado con tintes que pueden teñir ambos tipos de células, asegúrese de lavar cualquier tinte restante antes de combinar los neutrófilos y las biopelículas para evitar la tinción cruzada.