Un ensayo in vitro para estudiar la interacción entre los neutrófilos y el biofilm

Resumen

Fuente: Rana, P. S. J. B., et al. Ensayos in vitro estandarizados para visualizar y cuantificar las interacciones entre neutrófilos humanos y las biopelículas de Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2022)

Este video muestra un ensayo in vitro para estudiar la interacción entre neutrófilos y biopelícula. Las bacterias patógenas incrustadas en la biopelícula y los neutrófilos aislados se marcaron mediante marcadores fluorescentes, y la respuesta inmunitaria de los neutrófilos y la evasión de la respuesta inmunitaria de las bacterias se evaluaron mediante un microscopio de fluorescencia.

Protocolo

1. Preparación de biofilm in vitro

1. Obtener colonias aisladas de S. aureus a partir de una cepa criopreservada utilizando una técnica de placa de rayas en una placa de agar rica en nutrientes, como el agar de soja tríptico (ver Tabla de Materiales).
2. Cubra los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos con 100 μL de poli-L-lisina (PLL) al 0,001% (v/v) diluido en H₂O estéril e incube a temperatura ambiente durante 30 min. Asépticamente, aspire la solución de PLL utilizando una trampa de aspiración asistida por vacío. Deje que los pozos se sequen durante la noche a temperatura amb....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Riego con cloruro de sodio al 0,9%, USP	Baxter	2F7124	Libre de endotoxinas; Se utiliza para el aislamiento de neutrófilos
Unidad de filtro de flujo rápido de 150 mL	Termo Científico	565-0020
Etanol de 200 grados	VWR	89125-188
Jeringa de 3 mL	Bd	309657	Se utiliza para la extracción de sangre
Tubos de centrífuga cónicos de 50 mL	Termo Científico	339652
Jeringa de 60 mL	Bd	309653	Se utiliza para la extracción de sangre
agar-agar	Biorreactivos de Fisher	BP1423-2
Hisopo con alcohol	Bd		Se utiliza para la extracción de sangre
Curitas			Se utiliza para la extracción de sangre
BD Bacto Caldo de Soja Tríptico	Bd	DF0370-07-5	Combine con agar al 1,5% para hacer agar de soja tríptico
Contador de células	Bal Saupply	202C
CellTracker azul CMCH	Invitrogen	C2111	Tinte CMAC azul (BCD)
Placas de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos con fondo transparente	Coprotagonista	3370
Gasa de algodón	Marca Pescadora	Teléfono 13-761-52	Se utiliza para la extracción de sangre
Tubos de cultivo	Marca Pescadora	Teléfono 14-961-27	Vidrio de borosilicato 13 x 100 mm
D-(+)-glucosa	sigma	G-8270
Dextrano de Leuconostoc spp.	sigma	31392-250G	Se utiliza para el aislamiento de neutrófilos
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco 1x	Gibco	14190-144
Homodímero de etidio-1	Invitrogen	L3224 B
Ficoll-Paque plus	Cytiva	17144003	Se utiliza para el aislamiento de neutrófilos (medio de gradiente de densidad)
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	Sin calcio, magnesio y rojo fenol
Hemotómetro	Línea brillante
heparina	Novaplus	NDC 63323-540-57	1000 unidades USP/mL, utilizado para la extracción de sangre
IMARIS 9.8	Instrumentos Oxford		Software de análisis de imágenes para microscopía
Medios esenciales mínimos (MEM) Alpha 1x	Gibco	41061-029
Aguja (23 G1)	Bd	305145	Se utiliza para la extracción de sangre
Nikon Eclipse Ti2	Nikon
Elementos NIS	Nikon		Cuantificación de neutrófilos muertos
Solución de poli-L-lisina	sigma	P4707-50ML
cloruro de sodio	Biorreactivos de Fisher	BP358-10	Se utiliza para el aislamiento de neutrófilos
Agua estéril para riego, USP	Baxter	2F7114	Libre de endotoxinas; Se utiliza para el aislamiento de neutrófilos
Set de infusión alada Surflo	Terumo	SC*19BLK	19 G x 3/4", utilizado para la extracción de sangre
Tinción azul de tripán (0.4%)	Gibco	15250-061
Tornicate			Se utiliza para la extracción de sangre
Agua destilada ultrapura	Invitrogen	10977015
Placas blancas opacas de 96 pocillos	halcón	353296	Cultivo de tejidos tratado y placa de fondo plano
μ-Diapositiva VI 0.4	Ibidi	80601	Corredera de μ

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