Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Preparación de ratones y DSS
- Mantenga a los ratones knockout (α-gustducin-/-) y a los ratones C57BL/6 de tipo salvaje (α-gustducin+/+) de tipo salvaje emparejados por edad, sexo y peso corporal individualmente en jaulas limpias.
nota: Los ratones knockout han sido retrocruzados con ratones C57BL/6 durante más de 20 generaciones y tienen un trasfondo genético C57BL/6 de casi el 100%.
- Disuelva 30 g de polvo de sulfato de dextrano sódico (DSS) en 1 litro de agua esterilizada en autoclave. Mezcle hasta que la solución se aclare para asegurar que la concentración de trabajo final sea del 3% (p/v).
nota: La solución DSS puede almacenarse a temperatura ambiente durante un máximo de 1 semana o a 4 °C hasta su uso.
>2. Inducción y evaluación de la colitis DSS en ratones
- Pesa y registra el peso corporal inicial de cada ratón. Coloque los ratones individualmente en jaulas de plástico estándar y etiquete las jaulas.
- Reemplace el agua potable regular con una solución DSS al 3% durante un total de 7 días a los que ambos grupos de ratones tengan acceso ad libitum.
- Mida el peso corporal del ratón, registre el consumo de solución DSS y recoja y examine las heces de cada ratón diariamente durante la administración de DSS. Observe la gravedad de la diarrea y el sangrado rectal y conviértalo en el índice de enfermedad inducida por el DSS.
- Durante el experimento, se calcula el porcentaje de pérdida de peso en comparación con el peso inicial y el índice de enfermedad para evaluar los síntomas de la colitis><.
nota: El índice de enfermedad se puntúa combinando las observaciones de diarrea y sangrado rectal y se define de la siguiente manera: 0 (heces normales, sin sangre), 1 (heces blandas, sin sangre), 2 (heces blandas, poca sangre), 3 (heces muy blandas, sangrado moderado) y 4 (heces acuosas, sangrado significativo). El índice de enfermedad se analiza diariamente para cada ratón.
- Al final del tratamiento DSS de 7 días, sacrifique a los ratones por dislocación cervical y continúe con los experimentos restantes.
>3. Preparación de muestras de tejido
- Coloque el ratón en posición supina y limpie la piel del abdomen con etanol al 70%. Haga una incisión de 3 cm de largo en la línea media del abdomen con unas tijeras pequeñas para exponer la cavidad abdominal.
- Use un par de pinzas para separar cuidadosamente el bazo de otros tejidos, luego extraiga el bazo y mida su tamaño.
- Identifique y levante el colon con fórceps y sepárelo del mesenterio circundante. Extraiga todo el colon hasta que el ciego y el recto sean visibles.
- Aísle el colon seccionándolo en el margen colonocecal y profundamente en la pelvis para liberar el colon proximal y distal, respectivamente. Luego, mida y registre la longitud del colon aislado. Tenga cuidado de no dañar el tejido colónico durante el procedimiento de disección.
- Enjuague el colon con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada con una jeringa de 10 ml equipada con una aguja de sonda nasogástrica para extraer las heces y la sangre hasta que el eluido esté completamente transparente.
- Para la identificación histológica, divida las muestras de tejido en partes iguales en tres partes: proximal, media y distal. A continuación, fije el tejido con un 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche a 4 °C.
- Para el análisis de la expresión de citoquinas, congele todo el colon rápidamente con nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C hasta su uso.
>4. Evaluación histológica de la gravedad de la colitis inducida por DSS
- Inmunohistoquímica
- Después de la fijación, sumerja el tejido en una solución de sacarosa al 30% en 1x PBS durante la noche en un tubo de 15 mL para crioproteger las muestras.
- Incruste el tejido en un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) y colóquelo a -20 °C hasta que el OCT se endurezca.
- Transfiera el bloque OCT que contiene el tejido a un criostato, ajuste el dial de grosor del criostato a 12 μm y corte y recoja secciones congeladas de 12 μm de grosor.
- Calentar las secciones de tejido recogidas de un criostato a 65 °C durante 20 min en una placa caliente. Lave las secciones en 1x PBS 3 veces, durante 10 minutos cada una. Incubar las secciones de tejido en peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min para eliminar la peroxidasa endógena. Lava las secciones 3 veces más. Bloquear los tejidos con tampón bloqueante (3% de albúmina sérica bovina (BSA), 0,3% de detergente no iónico, 2% de suero de cabra, 0,1% de azida sódica en 1x PBS) a temperatura ambiente durante 1 h o más.
- Reemplace el tampón de bloqueo con una solución que contenga los siguientes anticuerpos primarios específicos del tipo de células inmunitarias: CD45 para los leucocitos, CD3 para las células T, B220 para las células B, CD11b para los macrófagos y Ly6G para los neutrófilos. Incubar a 4 °C durante la noche.
- Eliminar los anticuerpos primarios de las secciones de tejido por aspiración. Lave las secciones con 1x PBS 3 veces, durante 10 minutos cada una. Incubar las secciones con anticuerpo secundario biotinilado, seguido de incubación con el complejo estreptavidina-HRP a temperatura ambiente.
- Incubar las secciones con una solución de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) para desarrollar un color marrón claro u oscuro y visualizar las células inmunorreactivas.
- Contratiñir las secciones con hematoxilina y amoníaco diluido al 0,3% (v/v). Tome imágenes de campo claro con un aumento de 10X bajo un microscopio.
- Utilice un programa de procesamiento de imágenes para identificar y cuantificar la población de las células inmunitarias marcadas tanto en el epitelio como en la lámina propia (debajo del epitelio) mediante la configuración de 2 mascarillas: utilice la primera mascarilla en la función basada en cubos de color para establecer un umbral de detección de color y medir las áreas reactivas al DAB coloreadas; utilice la segunda mascarilla para determinar las áreas totales del epitelio y los propietarios laminares en la sección examinada. Expresa la población de células inmunorreactivas como una relación entre el área de tinción de las células infiltradas y el área total del tejido examinado.
