Destrucción de células K562 por células mononucleares de sangre periférica expuestas a preparaciones de productos de tabaco

Resumen

Fuente: Arimilli, S. et al., Métodos para evaluar la citotoxicidad e inmunosupresión de preparaciones de productos de tabaco combustible. J. Vis. Exp. (2015)

En este video, estudiamos el efecto de un medio completamente acondicionado por humo, una preparación de producto de tabaco combustible, sobre la destrucción de células K562 por células mononucleares efectoras de sangre periférica.

Protocolo

1. Ensayo de matanza K562

NOTA: Las células K562 deben cultivarse a 37 °C y 5% de CO₂ con medio completo RPMI hasta que alcancen el 80% de confluencia antes del ensayo.

1. Prepare una solución madre de 5 mM de éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE) añadiendo 18 μl de DMSO al vial.
2. Diluya WS-CM o nicotina en una placa de 96 pocillos utilizando el medio completo RPMI hasta un volumen total de 100 μl/pocillo para lograr las unidades de equinicotina deseadas o las concentraciones de nicotina para cada pocillo.
   cautela: La nicotina es extremadamente tóxica y peligrosa para el medio ambiente.
3. Agregue 100 μl de PBMC en el medio completo RPMI a una concentración de 1,5 x 10⁶ células/pocillo. El volumen total de células con WS-CM o nicotina será de 200 μl/pocillo.
4. Cubra la placa e incube durante 3 horas a 37 °C y 5% de CO₂.
5. Lave las células K562 añadiendo 10 ml de DPBS y centrifugue a 400 x g durante 8 min en RT.
6. Vuelva a suspender las células con 10 ml de DPBS y cuente las células K562.
7. Prepare una solución de trabajo de CFSE añadiendo 1 μl de solución madre de CFSE a 1 ml de DPBS.
8. Añadir 1 ml de la solución de trabajo CFSE a 1 ml de la suspensión celular K562 que contiene 1 - 2 x 10⁷ células. Vértice e incube con precisión durante 2 minutos en RT.
9. Agregue inmediatamente 200 μl de FBS. Vértice e incube con precisión durante 2 minutos en RT.
10. Añadir 10 ml de medio completo RPMI y centrifugar el tubo a 400 x g durante 8 min a RT.
11. Retire el sobrenadante RPMI y rompa el pellet, y vuelva a suspender las células con 10 ml de medio completo RPMI, y cuente las células K562 marcadas con CFSE.
12. Lavar los PBMC centrifugando la placa a 300 x g durante 3 min en RT. Aspirar el sobrenadante decantando el líquido. Vuelva a colocar la tapa y el vórtice en la parte inferior de la placa. Añadir 200 μl de medio RPMI completo y repetir el paso de lavado una vez más.
13. Añada células K562 marcadas con CFSE en una proporción de 1:15 (100.000 K562s:1,5 x 10⁶ PBMCs) a cada pocillo de muestra de la placa PBMC y siga incubando durante 5 horas a 37 °C y 5% de CO₂.
14. Lavar la mezcla de células centrifugando a 300 x g durante 3 min en RT. Aspirar el sobrenadante desechando el líquido. Coloque la tapa y el vórtice en la parte inferior de la placa.
15. Añadir 200 μl de tampón de funcionamiento y repetir una vez más el paso de lavado descrito en el paso 14.
16. Agregue 95 μl de tampón de funcionamiento seguido de 5 μl de 7AAD a cada pocillo para un volumen total de 100 μl/pocillo. Incubar la placa en la oscuridad a RT durante 15 min.
17. Agregue 100 μl de tampón de funcionamiento a cada pocillo y transfiera todo el volumen de suspensión celular de cada pocillo de la placa a los tubos del grupo y adquiera las muestras en el citómetro de flujo.
18. Determine el porcentaje de células positivas para 7AAD y CFSE positivas mediante el software de análisis de citometría de flujo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
12 tubos de 75 tubos	Halcón BD	352058
Tubos cónicos de 15 ml	Corning	430790
Microtubos de 2 mL	Axygen	MCT-150-C-S
Tubos cónicos de 50 ml	Corning	430828
Botella de 500 ml	Corning	430282
7AAD	BD Pharmingen	559925
Placa de fondo plano de 96 pocillos	Termo Nunc	439454
Placas inferiores redondas de 96 pocillos	Halcón BD	353077
Campana de cultivo celular	Termo Científico	Serie 1300 A2
centrífuga	Eppendorf	58110R
CFSE (en inglés)	Sondas moleculares Life Technologies	C34554
Tubos de racimo	Corning	4401	Nocivo si se ingiere, cancerígeno
DMSO (sulfóxido de dimetilo)	Sigma-Aldrich	D8418
DPBS	Lonza	17-512F
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Unidad de filtrado	Nalgene	156-4020
Citómetro de flujo	BD Biociencias	FACS Canto II	8 colores a Ex 405 nm y Em785 nm.
Citómetro de flujo	BD Biociencias	FACS Calibur	4 colores a Ex 495 nm y Em 785 nm.
Software de análisis de citometría de flujo	Estrella del árbol	FlowJo
nicotina	Sigma-Aldrich	N3876	Toxicidad aguda, Peligro ambiental
Parafilm	Bemis	"M"
Paraformaldehido	Sigma-Aldrich	P6148	Inflamable, Irritación de la piel
Pluma/estreptococo	Tecnologías de Gibco Life	Números 15140-122
RPMI 1640	Tecnologías de Gibco Life	11875-093
Búfer en ejecución	Búfer de ejecución MACS, Miltenyi Biotech	130-091-221
Pipeta de transferencia	Fisher Científico	Teléfono 13-711-20
Base Tris	Sigma-Aldrich	T1503