>1. Prepare un medio sintético para fibrosis quística (SCFM2)
NOTA: La preparación de SCFM2 comprende tres etapas principales que se describen a continuación (Figura 1).
- Esterilización de mucina porcina
- Prepare mucina estéril a una concentración final de 5 mg/mL en SCFM2. Por ejemplo, para un volumen de 5 ml de SCFM2, pese 25 mg de mucina tipo II en una placa de Petri estéril y colóquela en un esterilizador ultravioleta (UV) durante 4 horas, agitando suavemente cada hora.
- Después de 4 h, transfiera la mucina tratada con UV a tubos de 1,7 ml esterilizados en autoclave en condiciones estériles y almacene a -20 °C.
- Para confirmar la esterilización completa, disuelva una muestra de mucina en un líquido estéril, como agua o caldo Luria-Bertani (LB), y observe bajo un microscopio><.
nota: La mucina esterilizada puede almacenarse a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
- Preparación de la base tamponada
- Prepare soluciones madre de sal y aminoácidos agregando las cantidades apropiadas en peso al agua desionizada como se indica en la Tabla 1. Filtre y esterilice todas las soluciones madre con un filtro de 0,22 μm, envuélvalas en papel de aluminio para protegerlas de la degradación de la luz y almacene a 4 °C durante un máximo de un mes.
- Prepare la base tamponada combinando 190 mL de agua desionizada con soluciones madre de aminoácidos y sal por los volúmenes enumerados en la Tabla 1. Ajuste la solución a pH 6.8 y aumente hasta un volumen final de 250 mL. Filtre-esterilice con un filtro de 0,22 μm y almacene a 4 °C durante un máximo de 30 días.
- La noche anterior al experimento, alícuota la cantidad deseada de base tamponada en un matraz de cultivo de vidrio y agregue mucina (5 mg/mL como se describe en el paso 1.1.1) y ADN de esperma de salmón purificado (0,6 mg/mL). Agitar suavemente, envolver en papel de aluminio y dejar a 4 °C durante la noche para permitir que la mucina y el ADN se disuelvan en la solución.
nota: Las alícuotas de ADN del esperma de salmón deben descongelarse en hielo, en vórtice y agregarse a la base tamponada y la mucina. Las soluciones madre de triptófano, asparagina y tirosina deben prepararse en soluciones de NaOH (consulte la Tabla 1 para las concentraciones) en lugar de agua desionizada. Mantenga la base tamponada y todas las soluciones madre envueltas en papel de aluminio para protegerlas de la exposición a la luz. La mayoría de las acciones se mantendrán estables hasta por un mes. Las culatas que se decoloran no deben usarse y deben reemplazarse antes de usarlas.
- Adición de existencias suplementarias
- El día del experimento, agregue las existencias enumeradas en la Tabla 2 a la base tamponada que contiene mucina y ADN.
nota: Prepare una solución fresca de FeSO4 el día del experimento, pero todas las demás existencias se pueden preparar con anticipación y almacenar durante 30 días a 4 °C. 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) contiene cloroformo. Manéjelo con precaución y no lo use cerca de llamas abiertas. Después de la adición de DOPC, incubar SCFM2 a 37 °C con agitación (250 rpm) durante al menos 20 min (para 5 mL de cultivo). Este período de incubación permite que el cloroformo en el DOPC se evapore. El matraz no debe ser hermético; En su lugar, cubra la abertura del matraz sin apretar con papel de aluminio.
>2. Evaluación en tiempo real de la tolerancia antimicrobiana en agregados bacterianos
- Preparar cultivos de la noche a la mañana
- La noche anterior al experimento, inocular 5 mL de caldo LB con varias colonias de Pa PAO1-pMRP9-113 de una placa de agar LB que contenga antibiótico (carbenicilina 300 μg/mL). Cultivar durante la noche a 37 °C con agitación a 250 rpm.
nota: Cultive cultivos durante la noche con la adición de antibióticos necesarios para la selección de los plásmidos requeridos (aquí, el plásmido de expresión de proteína fluorescente verde (GFP), pMRP9-1). Tenga en cuenta que las células de Pa deben lavarse antes de inocular SCFM2. LB puede ser sustituido por otros medios de laboratorio ricos para cultivos nocturnos. Todos los aislados bacterianos deben manipularse utilizando las pautas BSL-2 adecuadas a lo largo de este protocolo.
- Inocular SCFM2
- El día del experimento, diluir a fondo cultivos nocturnos de Pa 1:10 (cultivo: medio líquido) inoculando 500 μL en 5 mL de caldo LB fresco. Células de crecimiento hasta la fase logarítmica (60-90 min) a 37 °C con agitación a 250 rpm.
- Centrifugar los cultivos en fase logarítmica a 10.000 × g durante 5 min. Lave las células eliminando el sobrenadante y resuspendiéndolas en 3 mL de solución salina tamponada con fosfato esterilizada por filtro (PBS, pH 7.0). Repita dos veces y vuelva a suspender el pellet en un volumen final de 1 mL de PBS.
- Mida la absorbancia de las células lavadas utilizando un espectrofotómetro a 600 nm (OD600) y calcule el volumen de cultivo requerido para un OD600 inicial de 0,05 en 5 mL de SCFM2. Inocular Pa en el SCFM2 y el vórtice suavemente para distribuir las células por todas partes. Pipetear 1 mL del SCFM2 inoculado en cada cámara de una placa óptica de 4 pocillos, con fondo de vidrio, e incubar durante 4 h estáticamente a 37 °C.
nota: El tiempo de duplicación de los cultivos de Pa depende de la cepa y de la disponibilidad de oxígeno. En SCFM2, bajo las condiciones descritas aquí, el tiempo de duplicación de Pa es ~1.4 h.
>3. Visualización de agregados durante el tratamiento con antibióticos con microscopía de barrido láser confocal (CLSM)
NOTA: Esta sección describe el uso del microscopio de barrido láser confocal y el software de captura de imágenes para la obtención de imágenes de agregados de Pa en SCFM2. El objetivo es observar y caracterizar la biomasa bacteriana remanente (tolerante) después del tratamiento con antibióticos. Los pasos descritos se pueden realizar con éxito en otros microscopios confocal, aunque se debe consultar el manual de funcionamiento del instrumento para obtener orientación específica.
- Imagen Cultivos de Pa utilizando una cámara calentada o una microplaca calentada instalada en la platina del microscopio para mantener una temperatura ambiente de 37 °C. Inicie el módulo de incubación al menos 2 h antes del comienzo del experimento para permitir que todos los aparatos alcancen la temperatura deseada y reducir la expansión y el movimiento durante la recopilación de datos.
- Después de 4 h, transfiera los cultivos de SCFM2 que contengan células Pa a la platina de microscopio calentada. Designe 3 de los 4 pocillos como réplicas técnicas para el tratamiento con antibióticos, y considere el 4º pocillo como un control sin tratamiento, que contiene solo células Pa en SCFM2, sin antibióticos. Identifique los agregados mediante microscopía de campo claro dentro de la pestaña Localizar antes de cualquier excitación de los reporteros fluorescentes. Defina un área para la obtención de imágenes dentro de cada pozo y almacene su posición (coordenadas x-y-z) utilizando el módulo Posiciones en el software de generación de imágenes.
- Utilice un objetivo de inmersión en aceite de 63x para visualizar cultivos de Pa que contengan el plásmido de expresión de GFP pMRP9-1 en SCFM2 con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 509 nm. Tome imágenes utilizando la opción z-stack dentro del módulo de adquisición a intervalos de 1 μm (un total de 60 cortes). Utilice el módulo de promedio de línea para reducir la fluorescencia de fondo en el canal GFP dentro del volumen total de las imágenes de pila z de 60 μm (1.093,5 mm3). Tome imágenes de control de SCFM2 no inoculado utilizando configuraciones idénticas para determinar la fluorescencia de fondo para el análisis de imágenes.
nota: Las imágenes se adquieren produciendo imágenes de pila z de 8 bits de 512 píxeles x 512 píxeles (0,26 μm x 0,26 μm píxeles) que están a 60 μm de la base del cubreobjetos.
- Utilice la opción de serie temporal del software de adquisición de imágenes para capturar 60 cortes en cada posición (pozo) a intervalos de 15 minutos durante un período de 18 h. Utilice la estrategia de enfoque definido dentro del software para almacenar un plano focal para cada posición, al que se devuelve en cada punto de tiempo a lo largo del experimento.
- Después de un total de 4,5 h de incubación, obtenga imágenes de cada posición utilizando la configuración anterior para determinar la biomasa agregada dentro de cada uno de los cuatro pocillos antes de la adición del antibiótico.
- Después de 6 h de incubación total, agregue antibiótico a una concentración inhibitoria (CMI) 2 veces inferior a la mínima a cada réplica. Pipetear directa y suavemente en el centro del pocillo, justo debajo de la interfase aire-líquido. Mantenga todos los cultivos en la cámara confocal calentada.
nota: En este caso, se utilizó sulfato de colistina a una concentración de 140 μg/mL.
- Comience el tratamiento con imágenes después del tratamiento con antibióticos haciendo clic en la opción Iniciar experimento dentro del programa de imágenes.
nota: La concentración de antibiótico utilizada depende del antibiótico, el aislado de Pa, y de si el usuario desea examinar los efectos mortales o de tolerancia. Este experimento utiliza una sola dosis. Se pueden agregar dosis adicionales sin interrumpir los cultivos si es necesario.
>4. Tinción con yoduro de propidio de agregados de Pa
NOTA: El yoduro de propidio (PI) se utiliza comúnmente como reactivo de tinción para identificar células bacterianas no viables (muertas) en cultivo. En este caso, se utiliza para identificar los agregados sensibles al tratamiento antibiótico aplicado en la sección 3. A lo largo de este protocolo, la expresión y detección de GFP en las células Pa se utiliza como el principal indicador de la viabilidad celular. Este último paso permite utilizar una vez más las imágenes confocales para identificar la posición espacial de los agregados vivos/muertos en relación con los demás. Además, los agregados se identifican como vivos/muertos para una posterior clasificación de celdas en la sección 3.
- Después de 18 h, agregue PI a cada pocillo de la placa de fondo óptico de cuatro cámaras que contiene cultivos de SCFM2. Siga las instrucciones del fabricante para el volumen de PI y el tiempo de incubación (por ejemplo, ~2 μL por ml de cultivo, ~20-30 min).
>5. Aislar células vivas de agregados utilizando un enfoque de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)
NOTA: FACS presenta una poderosa plataforma para clasificar y aislar grupos de células de acuerdo con un fenotipo marcado con fluorescencia. En este caso, el FACS se utiliza para aislar agregados vivos (tolerantes a antibióticos) de agregados no viables.
- Después de la tinción con yoduro de propidio, retire los cultivos de la incubación y transfiéralos a un instrumento FACS en un recipiente aislado para mantener 37 °C.
- Ejecute alícuotas de 1 mL de agregados de Pa que contengan SCFM2 al caudal más bajo.
nota: Cada alícuota contendrá ~15.000 agregados.
- Para detectar GFP, ilumine las células con un láser de 488 nm y registre la altura de la señal fluorescente a 530/30 nm. Visualice la tinción PI por excitación con un láser de 561 nm y registre la altura de la señal fluorescente a 610/20 nm. Realice la clasificación con una boquilla de 70 u.
nota: Los agregados ordenados se pueden agrupar de varias maneras en función de la aplicación del usuario. En este caso, se utilizó FACS para clasificar agregados de Pa viables para la secuenciación de ARN aguas abajo.
Tabla 1: Preparación de las reservas de sal, aminoácidos, ADN y mucina necesarias para la base tamponada del medio sintético de esputo para fibrosis quística, SCFM2.
| químico | Concentración de existencias (m) | Concentración final (mM) | Notas |
| NaH2PO4 | 0.2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0.2 | 1.25 | |
| KNO3 | 1 | 0.35 | |
| K2SO4 | 0.25 | 0.27 | |
| NH4Cl | | 2.28 | Agregue sólido directamente a la base amortiguada |
| Kcl | | 14.94 | Agregue sólido directamente a la base amortiguada |
| NaCl | | 51.85 | Agregue sólido directamente a la base amortiguada |
| Mops | | 10 | Agregue sólido directamente a la base amortiguada |
| Ser | 0.1 | 1.45 | |
| Glu HCl | 0.1 | 1.55 | |
| pro | 0.1 | 1.66 | |
| Gly | 0.1 | 1.2 | |
| Ala | 0.1 | 1.78 | |
| Val | 0.1 | 1.12 | |
| Conocido | 0.1 | 0.63 | |
| Ile | 0.1 | 1.12 | |
| leu | 0.1 | 1.61 | |
| Orn HCl | 0.1 | 0.68 | |
| Lys HCl | 0.1 | 2.13 | |
| Arg HCl | 0.1 | 0.31 | |
| Trp | 0.1 | 0.01 | Preparado en NaOH de 0,2 M |
| áspid | 0.1 | 0.83 | Preparado en NaOH de 0,5 M |
| Tyr | 0.1 | 0.8 | Preparado en NaOH de 1,0 M |
| Thr | 0.1 | 1.07 | |
| Cys HCl | 0.1 | 0.16 | |
| Phe | 0.1 | 0.53 | |
| Su HCl H2O | 0.1 | 0.52 | |
| ADN de esperma de salmón | | 0,6 mg/ml | |
| Mucina porcina | | 5 mg/nL | |
Tabla 2: Preparación de existencias adicionales necesarias para la base tamponada del medio sintético de esputo para fibrosis quística, SCFM2.
| químico | Concentración de existencias (M) | Concentración final (mM) | Notas |
| Dextrosa (D-glu2cosa) | 1 | 3 | |
| Ácido L-láctico | 1 | 9.3 | Ajuste a pH 7.0 con NaOH |
| CaCl2*H2O | 1 | 1.75 | |
| MgCl2 * 6H2O | 1 | 0.61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 mg/mL | 0.0036 | Hacer fresco todos los días |
| N-acetilglucosamina | 0.25 | 0.3 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) | 25 mg/mL | 100 μg/mL | Incubar durante al menos 20 min a 37 °C después de la adición |
