Una técnica in vitro para el estudio de tratamientos antimicrobianos sobre agregados bacterianos

Resumen

Fuente: Gannon, A. D., et al. Herramientas para la evaluación en tiempo real de un modelo de infección por Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo muestra una técnica in vitro para estudiar el impacto del tratamiento antimicrobiano en los agregados de Pseudomonas aeruginosa (Pa). Las células Pa marcadas con fluorescencia se cultivan como agregados, imitando el patrón de crecimiento durante la infección. Al desafiar los agregados con una concentración subletal del antibiótico colistina, la evaluación en tiempo real de la interacción bacteria-antibiótico se realiza mediante microscopía de fluorescencia.

Protocolo

>1. Prepare un medio sintético para fibrosis quística (SCFM2)

NOTA: La preparación de SCFM2 comprende tres etapas principales que se describen a continuación (Figura 1).

1. Esterilización de mucina porcina
   1. Prepare mucina estéril a una concentración final de 5 mg/mL en SCFM2. Por ejemplo, para un volumen de 5 ml de SCFM2, pese 25 mg de mucina tipo II en una placa de Petri estéril y colóquela en un esterilizador ultravioleta (UV) durante 4 horas, agitando suavemente cada hora.
   2. Después de 4 h, transfiera la mucina tratada con UV a tubos de 1,7 ml esterilizados en....

Resultados

Figura 1: Preparación e inoculación del medio SCFM2. (A) La base tamponada se prepara utilizando las sales y aminoácidos enumerados en la Tabla 1 y la Tabla 2. La base tamponada puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 30 días, pero debe protegerse de la exposición a la luz. (B) La mucina y el ADN se añaden a una alícuota de base tamponada y se disuelven en la solución durante la noche a 4 °C. (.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aminoácidos
alanina	Acrs Orgánicos	56-41-7
Arginina HCl	Mp	1119-34-2
asparagina	Acrs Orgánicos	56-84-8	Preparado en NaOH de 0,5 M
Cistina HCl	Alfa Aesar	L06328
Ácido glutámico HCl	Acrs Orgánicos	138-15-8
glicina	Acrs Orgánicos	56-40-6
Histidina HCl H2O	Alfa Aesar	A17627
isoleucina	Acrs Orgánicos	73-32-5
leucina	Alfa Aesar	A12311
Lisina HCl	Alfa Aesar	J62099
metionina	Acrs Orgánicos	63-68-3
Ornitina HCl	Alfa Aesar	A12111
fenilalanina	Acrs Orgánicos	63-91-2
prolina	Alfa Aesar	A10199
serina	Alfa Aesar	A11179
treonina	Acrs Orgánicos	72-19-5
triptófano	Acrs Orgánicos	73-22-3	Preparado en NaOH de 0,2 M
tirosina	Alfa Aesar	A11141	Preparado en NaOH de 1,0 M
valina	Acrs Orgánicos	72-18-4
antibiótico
Carbenicillina	Alfa Aesar	J6194903
Día de las existencias
CaCl2* 6H2O	Fisher Chemical	C79-500
Dextrosa (D-glucosa)	Fisher Chemical	50-99-7
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)	Fisher (Lípidos polares de Avanti)	4235-95-4	Agitar 15-20 min a 37 °C para evaporar el cloroformo
FeSO4 * 7H2O	Acrs Orgánicos	7782-63-0	Este caldo equivale a 1 mg/mL, DEBE hacerse fresco
Ácido L-láctico	Alfa Aesar	L13242	Stock de pH a 7 con NaOH
MgCl2 * 6H2O	Acrs Orgánicos	7791-18-6
N-acetilglucosamina	TCI	A0092
Sólidos preparados
Mucina porcina	sigma	M1778-100G	Esterilización UV
ADN de esperma de salmón	Invitrogen	15632-011
mancha
Yoduro de propidio	Alfa Aesar	J66764MC
sales
K2SO4	Alfa Aesar	A13975
Kcl	Alfa Aesar	J64189	Agregue sólido directamente a la base amortiguada
KNO3	Acrs Orgánicos	7757-79-1
Mops	Alfa Aesar	A12914	Agregue sólido directamente a la base amortiguada
NaCl	Fisher Chemical	S271-500	Agregue sólido directamente a la base amortiguada
Na2HPO4	Rpi	S23100-500.0
NaH2PO4	Rpi	S23120-500.0
NH4Cl	Acrs Orgánicos	12125-02-9	Agregue sólido directamente a la base amortiguada
Consumibles
Tubos cónicos (15 mL)	Plásticos Olympus	28-101
Tubos cónicos (50 mL)	Plásticos Olympus	28-106
Tubos de cultivo con tapa de flujo de aire	Plásticos Olympus	21-129
Plato de fondo de vidrio de cuatro cámaras de 35	CellVis	NC0600518
Caldo Luria-Bertani (LB)	Genessee Científico	De 11 a 118
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Biorreactivos de Fisher	BP2944100
Puntas de pipeta (p200)	Plásticos Olympus	23-150RL
Puntas de pipeta (p1000)	Plásticos Olympus	23-165RL
Pipetas serológicas (5 mL)	Plásticos Olympus	12-102
Pipetas serológicas (25 mL)	Plásticos Olympus	De 12 a 106
Pipetas serológicas (50 mL)	Plásticos Olympus	12-107
Agua ultrapura (libre de ARNasa/ADNasa); agua nanopura	Genessee Científico	De 18 a 194	Agua nanopura utilizada para la preparación de soluciones en la Tabla 1
Jeringas (10 mL)	Bd	794412
Jeringas (50 mL)	Bd	309653
Filtro de jeringa PES de 0,22 mm	Plásticos Olympus	25-244
Cubeta PS semi-mico	Plásticos Olympus	91-408
software
Biorender			Para preparar las figuras
FacsDiva6.1.3	Becton Dickinson, San José, CA
Imaris	Plano de bits		Versión 9.6
Negro Zen
equipo
FacsAriallu	Becton Dickinson, San José, CA
Microscopio de barrido láser confocal LSM 880	Zeiss

mm años años años