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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparando las células para la infección
- Propagar la línea celular RAW 264.7 similar a los macrófagos de ratón en un medio de cultivo de tejidos DMEM suplementado con un 10% de suero fetal de ternero (en adelante, DMEM/FCS) utilizando un matraz de 125 ml y una incubadora de cultivo de tejidos mantenida a 37 °C/5% de CO2.
- El día antes de la infección, use un raspador de células para extraer las células del matraz de expansión y recójalas en un tubo cónico con tapón de rosca de 15 mL. Centrifugar las células a 800 x g durante 10 min, decantar el sobrenadante, suspender el pellet de la célula en 1 mL de DMEM/FCS (sin antibióticos) y determinar el título utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
- Ajuste el título a 2 x 106 células/ml y agregue 0,10 ml (2 x 105 células) a los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos. Asegúrese de que la suspensión de la celda cubra toda la superficie del pozo.
- Placas de celdas en pocillos adicionales para una fuente posterior de medios acondicionados. Además, coloque 0,10 mL de DMEM/FCS en tres pocillos adicionales para que sirvan como "control sin células".
- Incubar durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C/5% CO2. Al día siguiente, no lo retire de la incubadora hasta que el inóculo de la bacteria esté preparado y listo para usar.
>2. Preparación de Listeria monocytogenes (Lm) para la infección
- Inocular 2 mL de infusión cerebro-corazón (BHI) con una sola colonia de una placa de agar recién rayada (<2 días) de Lm e incubar durante la noche a 37 °C con agitación a 130 rotaciones/min.
- Al día siguiente, añadir 0,10 mL de cultivo durante la noche a 2 mL de BHI precalentado y continuar incubando a 37 °C con agitación hasta que la densidad óptica (OD600) esté entre 0,4 y 0,6.
- Determine el título bacteriano aproximado utilizando una fórmula de conversión derivada empíricamente. En nuestro laboratorio, un cultivo de Lm en crecimiento exponencial en BHI es de aproximadamente 1,3 x 109 unidades formadoras de colonias (UFC)/OD600. Minimice la cantidad de tiempo que los cultivos bacterianos están expuestos a temperatura ambiente.
- Justo antes de la infección, ajuste el título a 5 x 107 UFC/mL utilizando DMEM/FCS precalentado como diluyente.
3. Infección
- Trabajando de forma rápida y precisa, añada 20 μL (1 x 106 UFC; multiplicidad de infección, MOI = 5) del inóculo Lm recién preparado (paso 2.4 anterior) a los pocillos inclinando ligeramente la placa y colocando cuidadosamente la punta de la pipeta en el medio suprayacente;
NOTA: Evite tocar las paredes del pocillo con la punta de la pipeta.
- Pipetear suavemente el contenido de cada pocillo para asegurar una mezcla completa; no agite ni incline significativamente la placa, ya que esto extenderá Lm sobre las paredes del pocillo. Vuelva a colocar la placa de cultivo celular en una incubadora deCO2 a 37 °C/5 %.
- Prepare una solución de gentamicina de 10 μg/mL utilizando medios acondicionados de pocillos no infectados como diluyente.
- A los 30 minutos después de la infección (mpi), añadir cuidadosamente 30 μL de la solución de gentamicina (concentración final de 2,5 μg/mL) y pipetear suavemente el contenido del pocillo como antes y devolver la placa de cultivo celular a la incubadora de 37 °C/5% CO2.
- A 60 mpi, coseche los pozos apropiados para el ensayo de UFC (punto de tiempo de 60 mpi) o el análisis de FCM (como se describe a continuación en las secciones 4 y 5, respectivamente).
- En el caso de los pocillos restantes, en varios momentos posteriores se deben recolectar las células como antes o, para el ensayo de emergencia de Lm, eliminar completamente el medio del pocillo y reemplazarlo con 150 μL de medio acondicionado sin gentamicina.
>4. Procesamiento de muestreo y análisis de Lm intracelular y emergente mediante ensayo CFU
- Para cosechar, incline ligeramente el plato y retire con cuidado todo el medio del pozo. Agregue 0,50 mL de agua destilada estéril (dsH2O) al pocillo. Después de 30 s, transfiera el lisado de agua resultante (100) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y haga un vórtice vigoroso durante 10 s.
- Prepare diluciones 10-1 y 10-2 añadiendo 4,5 μL o 50 μL de lisado de agua a 450 μL de dsH2O y un breve vórtice para asegurar una mezcla completa.
- Extienda 50 μL de las muestras 100, 10-1 y/o 10-2 en placas de agar caldo de lisogénia (LB).
- Para determinar la presencia de Lm emergente (paso 3.6 anterior), extraiga 10 μL del medio superpuesto y divídalo en dos alícuotas de 5 μL: a una alícuota añadir 5 μL de DMEM/FCS y a la segunda alícuota añadir 5 μL de DMEM/FCS que contenga 5 μg/mL de gentamicina. Este último control distingue entre Lm extracelular (sensible a la gentamicina) y Lm intracelular (resistente a la gentamicina) en el ensayo posterior de UFC.
- Después de 5 minutos a temperatura ambiente, agregue 90 μL de dsH2O, vórtice vigorosamente durante 10 s y extienda 50 μL en placas de agar LB.
- Enumerar las colonias de Lm en placas de agar LB después de 2 días de incubación a 37 °C.