Análisis por citometría de flujo de Listeria monocytogenes intracelular y extracelular emergente in vitro

Resumen

Fuente: Gayle, P. et al., Uso de un patógeno bacteriano para sondear las respuestas del huésped a nivel celular y organísmico. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, cuantificamos Listeria monocytogenes intracelular y extracelular, una bacteria patógena intracelular, después de su infección de macrófagos cultivados in vitro mediante citometría de flujo.

Protocolo

1. Procesamiento de muestreo y análisis de Lm intracelular y emergente por citometría de flujo (FCM)

1. Prepare la línea celular RAW 264.7 similar a los macrófagos de ratón en un medio de cultivo de tejidos DMEM suplementado con un 10% de suero fetal de ternero (en lo sucesivo denominado DMEM/FCS) utilizando un matraz de 125 ml y una incubadora de cultivo de tejidos mantenida a 37 °C/5% de CO₂. Ajuste las celdas a 1 x 10⁶ células/mL y agregue 1 mL (1 x 10⁶ células) a los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos.
2. Preparar inóculo de bacterias Listeria monocytogenes, Lm, e infectar las células con el volumen de inóculo correspondiente a un MOI de 50 (5 x 10⁷ UFC).
3. A las 1,5 horas después de la infección (hpi), recoja los medios del primer conjunto de pocillos y colóquelos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 500 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% y colóquelos en hielo hasta que se hayan procesado todos los pocillos.
4. Para recolectar Lm intracelular, agregue 1 mL de ds H₂O al pocillo y después de 60 s, transfiera el lisado de agua resultante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 500 μL de PFA al 4%. Agite el vórtice vigorosamente durante 10 segundos y colóquelo en hielo hasta que se hayan procesado todos los pozos.
5. Para los pocillos restantes, retire el medio y reemplácelo con 1 mL de DMEM/FCS con 5 μg/mL de gentamicina para matar la Lm extracelular y devolver rápidamente las células a la incubadora.
6. Después de 30 minutos (2 hpi), retire el medio y reemplácelo con DMEM/FCS sin gentamicina.
7. Después de 2 y 4 h (4 y 6 hpi) tome el segundo y tercer punto de tiempo recolectando medios y lisados.
8. Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 7 min. Eliminar el sobrenadante sin alterar el pellet.
9. Suspenda cada pellet en un cóctel de tinción de 50 μL de PFA al 4% y 15 μL de faloidina. Incubar los tubos en la oscuridad a 4 °C durante 20 min.
10. Después de la incubación, agregue 1 ml de tampón FACS a cada tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
11. Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 7 min. Retirar el sobrenadante sin alterar el pellet.
12. Suspenda cada pellet en 400 μL de tampón FACS para uso inmediato, o 200 μL de tampón FACS y 200 μL de PFA al 4% si se almacena para análisis posterior.
13. Ejecute muestras en citometría de flujo y analice los datos recopilados.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caldo BHI (Brain Heart Infusion)	EMD Milipore	110493
Filtro de células, 70 μm	VWR	10199-656
Colagenasa D	Roche	11088858001
Medios DMEM	Gibco	11965-092
Tubos FACS	Halcón BD	352054
FBS - Inactivado por calor	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
Solución de sal equilibrada de Hanks	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
Agar LB	Células de cultivo MS	MBPE-4040
Kit de tinción de células muertas amarillas reparables LIVE/DEAD	Tecnologías de la Vida	L349S9
Rodamina Faloidina	Termo Fischer	R415
Analizador espectral SP6800	Sony
Placas de cultivo de tejidos TPP de 48 pocillos	MIDSCI	TP92048
Placas de cultivo de tejidos TPP de 6 pocillos	MIDSCI	TP92406