1. Recolectar y preparar moscas
- Trasero de Drosophila melanogaster en las condiciones experimentales deseadas. Tenga cuidado de no abarrotar las moscas durante la cría y asegúrese de que las densidades larvales sean consistentes en todos los tratamientos, ya que las condiciones ambientales durante la etapa larvaria pueden afectar profundamente los fenotipos de defensa inmune durante la etapa adulta.
- Recoja las moscas experimentales de 0 a 3 días después de la eclosión de la caja de la pupa y transfiérelas a un medio fresco.
- Aloje las moscas recolectadas a la temperatura deseada (generalmente son adecuadas temperaturas entre 22 °C y 28 °C) hasta que envejezcan 5 a 7 días después de la eclosión><.
nota: Esto permite tiempo suficiente para que las moscas completen la metamorfosis y se conviertan en adultas maduras, pero es mucho antes de que comience la senescencia.
- Clasifique el número deseado de moscas en un vial separado antes de la infección, nuevamente teniendo cuidado de evitar el hacinamiento.
nota: En esta demostración sólo se infectan los machos, pero es igualmente posible infectar a las hembras utilizando el procedimiento descrito.
>2. Cultivo y preparación de bacterias
- Prepare una placa maestra de las bacterias elegidas al menos 2 días antes de la infección. Elimine las bacterias de un caldo de glicerol al 15% almacenado indefinidamente a -80 °C. Guarde la placa maestra a 4 °C durante un máximo de 2 semanas. Raye siempre las placas maestras directamente del caldo de glicerol congelado. Evite el paso en serie de bacterias de una placa a otra, ya que el paso repetido en cultivo puede hacer que las bacterias desarrollen una virulencia atenuada.
nota: En este ejemplo se utilizan Providencia rettgeri y Escherichia coli.
- Utilice el siguiente procedimiento para preparar una suspensión bacteriana para inyección.
- Cultive un cultivo de bacterias de 2 ml inoculando un medio estéril con una sola colonia aislada de la placa maestra. Cultive las bacterias hasta la fase estacionaria (por ejemplo, crecimiento O/N a 37 °C).
nota: Tanto P. rettgeri como E. coli crecen bien en el caldo Luria a temperaturas de 20 a 37 °C con una agitación suave.
- Una vez que el cultivo haya alcanzado la fase estacionaria, granular suavemente las células de aprox. 600 μl del cultivo en una centrífuga de mesa (3 min a 5.000 x g), desechar el sobrenadante y resuspender las bacterias en aprox. 1.000 μl de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS; 137 mM Cloruro de sodio, NaCl, 2,7 mM de cloruro de potasio, KCl, fosfato sódico 10 mM, Na2PO4, fosfato dihidrógeno potásico 1,8 mM, KH2PO4, pH = 7,4).
- Diluir las células resuspendidas en PBS estéril para lograr una densidad óptica (DO) apropiada para la bacteria que se está utilizando, medida con un espectrofotómetro como absorbancia a 600 nm. Use esta suspensión para infectar las moscas.
nota: A600 = 0,1 o 1,0 corresponde, respectivamente, a aproximadamente 10,8 y 109 Providencia rettgeri o E. coli por ml. Debido a que tanto las bacterias vivas como las muertas contribuyen a la densidad óptica, es importante cosechar cultivos temprano en la fase estacionaria antes de que los cadáveres bacterianos se acumulen y distorsionen la relación entre la densidad óptica y el número de bacterias viables introducidas durante la infección.
>3. Infectar las moscas
NOTA: Dado que la inmunidad de Drosophila está influenciada por el ritmo circadiano, es importante realizar infecciones a una hora similar del día en todas las réplicas experimentales.
- Uso de un nanoinyector
- Prepare las agujas de vidrio para la infección.
- Prepare una aguja de vidrio tirando de un capilar de vidrio de borosilicato con un extractor de micropipetas.
- Con pinzas, rompa la punta de la aguja para crear una abertura de aproximadamente 50 μm de diámetro para permitir la expulsión del líquido.
- Ensamble el inyector.
- Coloque la junta tórica de sellado y luego el espaciador blanco (hoyuelo grande hacia afuera) en el émbolo de metal.
- Llene la aguja de vidrio con aceite mineral usando una jeringa con una aguja de 30 G.
- Pase la aguja de vidrio llena a través de la boquilla y luego coloque la junta tórica más grande alrededor de su base, aproximadamente a 1 mm del extremo romo de la aguja.
- Deslice la aguja sobre el émbolo de metal y atornille suavemente la boquilla hasta que esté segura.
- Expulse la mayor parte del aceite mineral del inyector, pero asegúrese de que todavía haya un pequeño volumen de aceite en la aguja para que actúe como una barrera entre el inyector y la suspensión bacteriana. Asegúrese de que no haya burbujas de aire dentro del aceite mineral o la suspensión bacteriana, o entre los dos líquidos.
- Ajuste el inyector al volumen deseado para la inyección (entre 9 nl y 50 nl).
- Generar controles de heridas.
- Llene la aguja del inyector con PBS estéril insertando cuidadosamente la punta de la aguja capilar en un tubo del medio y presionando el botón de "llenado" en el inyector.
nota: Los medios de crecimiento bacteriano estériles también se pueden utilizar como control de heridas si el experimento requiere la inyección de bacterias suspendidas en su medio de crecimiento. Sin embargo, debido a que los medios de crecimiento bacteriano contienen componentes que pueden estimular el sistema inmunológico o tener otros efectos en el huésped, es preferible un portador inerte como el PBS.
- Anestesiar el número deseado de moscas bajo un ligero flujo de dióxido de carbono (CO2).
- Inyecte las moscas en la parte anterior del abdomen en la superficie ventrolateral con el PBS estéril.
nota: También es posible inyectar moscas en otros sitios, como la placa esternopleural del tórax, pero es importante mantener el sitio de inyección consistente dentro de cada experimento.
- Coloque las moscas inyectadas en viales nuevos con un medio nuevo, colocando los viales de lado hasta que todas las moscas se hayan recuperado de la anestesia para evitar que las moscas se peguen a la comida.
nota: Se recomienda inyectar las moscas de control PBS antes de inyectar bacterias en moscas experimentales para que se pueda usar la misma aguja para ambos tratamientos. No siempre será posible utilizar la misma aguja para todo un experimento. En ese caso, puede ser conveniente registrar qué aguja se utilizó con qué moscas e incluir la identidad de la aguja como un factor experimental en el análisis estadístico.
- Inyecta el patógeno bacteriano.
- Expulse los medios estériles restantes del inyector y vuelva a llenar la misma aguja con la suspensión bacteriana.
- Repita el procedimiento anterior (3.1.3), inyectando ahora a las moscas la suspensión bacteriana preparada en el procedimiento 2.2.
