1. Recolectar y preparar moscas
- Criar D. melanogaster en las condiciones experimentales deseadas. Tenga cuidado de no abarrotar las moscas durante la cría y asegúrese de que las densidades larvales sean consistentes en todos los tratamientos, ya que las condiciones ambientales durante la etapa larvaria pueden afectar profundamente los fenotipos de defensa inmune durante la etapa adulta.
- Recoja las moscas experimentales de 0 a 3 días después de la eclosión de la caja de la pupa y transfiérelas a un medio fresco.
- Aloje las moscas recolectadas a la temperatura deseada (generalmente son adecuadas temperaturas entre 22 °C y 28 °C) hasta que envejezcan 5 a 7 días después de la eclosión><.
nota: Esto permite tiempo suficiente para que las moscas completen la metamorfosis y se conviertan en adultas maduras, pero es mucho antes de que comience la senescencia.
- Clasifique el número deseado de moscas en un vial separado antes de la infección, nuevamente teniendo cuidado de evitar el hacinamiento.
nota: En esta demostración sólo se infectan los machos, pero es igualmente posible infectar a las hembras utilizando el procedimiento descrito.
>2. Cultivo y preparación de bacterias
- Prepare una placa maestra de las bacterias elegidas al menos 2 días antes de la infección. Elimine las bacterias de un caldo de glicerol al 15% almacenado indefinidamente a -80 °C. Guarde la placa maestra a 4 °C durante un máximo de 2 semanas. Raye siempre las placas maestras directamente del caldo de glicerol congelado. Evite el paso en serie de bacterias de una placa a otra, ya que el paso repetido en cultivo puede hacer que las bacterias desarrollen una virulencia atenuada.
nota: En este ejemplo se utilizan Providencia rettgeri y Escherichia coli.
- Utilice el siguiente procedimiento para preparar una suspensión bacteriana para inyección.
- Cultive un cultivo de bacterias de 2 ml inoculando un medio estéril con una sola colonia aislada de la placa maestra. Cultive las bacterias hasta la fase estacionaria (por ejemplo, crecimiento O/N a 37 °C).
nota: Tanto P. rettgeri como E. coli crecen bien en el caldo Luria a temperaturas de 20 a 37 °C con una agitación suave.
- Una vez que el cultivo haya alcanzado la fase estacionaria, granule suavemente las células de aprox. 600 μl del cultivo en una centrífuga de mesa (3 min a 5.000 x g), deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las bacterias en aprox. 1.000 μl de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4).
- Diluir las células resuspendidas en PBS estéril para lograr una densidad óptica (DO) apropiada para la bacteria que se está utilizando, medida con un espectrofotómetro como absorbancia a 600 nm. Utilice esta suspensión para infectar las moscas.
nota: A600 = 0,1 o 1,0 corresponde, respectivamente, a aproximadamente 10,8 y 109 Providencia rettgeri o E. coli por ml. Debido a que tanto las bacterias vivas como las muertas contribuyen a la densidad óptica, es importante cosechar cultivos temprano en la fase estacionaria antes de que los cadáveres bacterianos se acumulen y distorsionen la relación entre la densidad óptica y el número de bacterias viables introducidas durante la infección.
>3. Infectar las moscas
NOTA: Dado que la inmunidad de Drosophila está influenciada por el ritmo circadiano, es importante realizar infecciones a una hora similar del día en todas las réplicas experimentales.
- Con pinchazo séptico
- Prepare la aguja para pinchar.
- Derrita el extremo de la punta de una micropipeta de 200 μl e inserte un alfiler de minucias de insectos de 0,15 mm en el plástico fundido. Deje que el plástico se solidifique de tal manera que el alfiler se mantenga en su lugar con aproximadamente 0,5 cm del alfiler que se extienda desde el plástico.
- Generar controles de heridas.
- Anestesiar el número deseado de moscas bajo un ligero flujo de CO2.
- Pinchar las moscas en la placa esternopleural del tórax con la aguja, evitando los sitios de unión de las alas y las patas. Si es necesario, retire suavemente las moscas del alfiler minuciénico con pinzas blandas.
nota: También es posible pinchar las moscas en otros sitios, como el abdomen anterior en la superficie ventrolateral, pero es importante mantener el sitio de inyección consistente dentro de cada experimento. Pinchar a través de la cutícula del abdomen tiende a ser más difícil que pinchar el tórax y, por lo tanto, es menos común.
- Coloque las moscas pinchadas en un frasco nuevo con un nuevo medio para moscas, colocando el frasco de lado hasta que todas las moscas se hayan recuperado de la anestesia para evitar que las moscas se peguen a la comida.
- Introduce la infección bacteriana.
- Anestesiar el número deseado de moscas bajo un ligero flujo de CO2.
- Pinche cada mosca en el mismo lugar que los controles del medio, sumergiendo la punta del alfiler en la suspensión bacteriana preparada en el procedimiento 2.2 antes de pinchar cada mosca.
- Coloque las moscas pinchadas en un frasco nuevo con un nuevo medio para moscas, colocando el frasco de lado hasta que todas las moscas se hayan recuperado de la anestesia para evitar que las moscas se peguen a la comida.