Medición de la carga bacteriana de E. coli en Drosophila melanogaster después de una infección por E. coli

Resumen

Fuente: Khalil, S., et al. Infección bacteriana sistémica y fenotipos de defensa inmune en Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2015)

En este video, demostramos una técnica para medir la carga bacteriana de E. coli después de inyectar E. coli en el tórax de Drosophila melanogaster.

Protocolo

1. Ensayo Carga bacteriana post-infección

1. Mide la carga bacteriana.
   1. A un tiempo prescrito después de la inyección, coloque cada mosca en un tubo de microcentrífuga sobre hielo.
   2. Agregue 250 μl de PBS a cada tubo y homogeneice las moscas con un mortero o un batidor de cuentas.
   3. Coloque el homogeneizado en una placa de agar LB, ya sea usando un plato en espiral o una dilución en serie.
      1. Para colocar en una placa con dilución en serie, transfiera cada homogeneizado de moscas a la primera fila de una placa de 96 pocillos.
      2. Llene cada pocillo de las filas restantes con 90 μl de PBS.
      3. Con una pipeta multicanal, tome 10 μl de la primera fila que contenga homogeneizado de mosca y dispense en la segunda fila.
      4. Pipetear hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces para mezclar bien, y luego tomar 10 μl y transferir a la tercera fila. Repita este procedimiento con las filas restantes.
      5. Comenzando desde la fila inferior (suspensión de bacterias más diluida), use la pipeta multicanal para tomar 10 μl de cada pocillo y depositar en una placa LB, teniendo cuidado de que las muestras se dispensen como puntos discretos que no se toquen entre sí. Repita hasta que se hayan tomado muestras de todos los pocillos de cada fila, dispensándolos en orden descendente de dilución en la placa LB.
      6. Deje la placa en RT hasta que las manchas se hayan empapado completamente en la placa LB.
         nota: Se recomienda secar la placa LB durante unos días en RT antes de su uso para garantizar que el líquido se absorba fácilmente, minimizando las posibilidades de contacto accidental entre los puntos de muestra.
   4. Incubar las placas O/N, teniendo cuidado de no crecer demasiado para que las colonias permanezcan pequeñas y discretas.
      nota: Dependiendo del medio de crecimiento bacteriano y de la temperatura de incubación utilizada, pueden acabar apareciendo en la placa colonias derivadas de la microbiota intestinal endógena de la mosca. Sin embargo, la mayoría de las bacterias utilizadas para la infección patógena crecen mucho más rápido que la microbiota intestinal en agar LB a 37 °C.
   5. Retire las placas de la incubadora cuando las bacterias experimentales hayan desarrollado colonias visibles (normalmente de 8 a 12 horas), pero antes de que aparezcan las colonias de microbiota intestinal de Drosophila (aproximadamente 36 horas). En el caso de las bacterias experimentales de crecimiento lento, utilice un antibiótico selectivo en el agar LB para eliminar las colonias de la microbiota intestinal.
   6. Cuente el número de colonias para cada homogeneizado.
      1. En el caso de las placas en espiral, cuente las colonias que crecen utilizando un contador de colonias automatizado que puede estimar la carga bacteriana por ml de homogeneizado en función del número y la posición de las colonias en la placa><. NOTA: Los recuentos en espiral son más precisos cuando la concentración bacteriana está en el rango de 5 x 10² a 5 x 10⁴ bacterias por ml.
      2. En el caso de las placas puntuales, cuente manualmente las colonias de cada mosca de la dilución que contenga de 30 a 300 colonias y calcule el número de bacterias por ml de homogeneizado original.
2. Analice los datos.
   1. Si la carga bacteriana no es normal, transforme los datos para aproximarse mejor a una distribución normal o analice los datos utilizando un análisis estadístico no paramétrico (por ejemplo, prueba U de Mann-Whitney). Utilice un análisis de Box-Cox para encontrar la transformación óptima; Las transformaciones logarítmicas naturales o logarítmicas en base -10 suelen ser eficaces.
   2. Si los datos están suficientemente distribuidos de forma normal y solo se contrastan dos tratamientos, se realiza una prueba t para determinar si los dos tratamientos dan lugar a cargas bacterianas medias diferentes. Si hay múltiples variables experimentales u otros factores potencialmente predictivos, utilice el análisis de varianza (ANOVA) para determinar qué factores son predictores significativos de la carga bacteriana.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de Petri con Tapas Transparentes, Cresta Elevada; 100 x 15 mm;	VWR internacional	25384-302
LB Agar, Molinero	Difco	244520
Asa de inoculación	VWR internacional	80094-488
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml; Rito del sello	USA Scientific Inc.	1615-5500
mortero motorizado; Agitador de laboratorio Talboys	Troemner	Artículo 103
Homogeneizador de alto rendimiento Talboys	Diagnóstico de OPS	930145
Bolas de molienda de 5/32''	Diagnóstico de OPS	GBSS 156-5000-01
Genio del vórtice	Industrias científicas inc.	G560
Pipeta multicanal (10uL-300uL)	sartorio	730360
WASP2 Whitley Plato Espiral Automatizado	Microbiología Internacional
Contador de colonias automatizado ProtoCOL / contador de placas / lector de placas	Microbiología Internacional
incubadora	Poderes Científicos, Inc	DROS52SD