Ensayo para determinar la dosis infecciosa del virus Drosophila C en células de insectos cultivadas

Resumen

Fuente: Yang, S. et al., Establecimiento de la infección viral y análisis de la interacción huésped-virus en Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, demostramos el ensayo de efecto citopático para determinar la dosis viral infecciosa de cultivo de tejidos del virus Drosophila C en células Drosophila S2*. Se utiliza una variedad de concentraciones virales para infectar las células cultivadas. Se determina la proporción de células que presentan cambios estructurales y estos datos se utilizan para calcular la dosis infectiva del cultivo de tejidos.

Protocolo

1. Medición de la carga del virus de Drosophila C mediante ensayo CPE

1. Elija 5 tubos aleatorios que contengan virus para determinar la dosis infectiva promedio de cultivo de tejido viral (TCID₅₀) mediante un ensayo de efecto citopático (CPE) (1 unidad de TCID₅₀ = 0,7 unidad formadora de placa [PFU]).
   nota: La CPE se refiere a los cambios estructurales en las células huésped causados por la invasión viral. El virus infeccioso causa lisis de la célula huésped o cuando la célula muere sin lisis debido a la incapacidad de reproducirse.
2. El día 1, recoja las células S2* preparadas mediante pipeteo. Cuente el número de celda. Centrifugar las celdas durante 300 x g durante 4 min y desechar el sobrenadante. Diluya las células hasta la densidad de 1 x 10⁶ células/ml con un medio completo para células S2*.
3. Siembre 1 x 10⁵ celdas S2* (100 μL) por pocillo hasta la placa de fondo plano de 96 pocillos (~30% de confluencia).
4. Realice diluciones en serie de 10 veces el stock de DCV con medio completo para células S2*. Agregue diluciones de 50 μL en el pocillo. Añadir 50 μL de medio de cultivo sin virus al pocillo clasificado como pocillo testigo negativo.
   nota: Para cada tasa de dilución se utilizaron 8 pocillos. Como el rendimiento típico de DCV es de alrededor de 10^{8-10 9} PFU/mL, la dilución debería cubrir al menos ~10-5-10-10.
5. El día 4, observe la EPC con un microscopio de campo claro con un objetivo de 20X o 40X. Clasifique un pocillo en el que las células se ven borrosas y el medio está lleno de fragmentos como un "pozo positivo", y un pocillo en el que la morfología celular es normal como un "pozo negativo".
6. Marque los pozos positivos o negativos de CPE con + o –, respectivamente. Calcular el virus TCID₅₀ por el método de Reed y Muench.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	marca	352070
Plato de cultivo celular de 10 cm	sigma	CLS430167	cultivo celular
Incubadora de células	Sanyo	MIR-553
centrífuga	Eppendorf	5810R
centrífuga	Eppendorf	5424R
Incubadora Drosophila	Percival	I-41NL	Crianza de Drosophila
FBS	Invitrogen	12657-029	cultivo celular
Medio para insectos de Schneider	sigma	S9895	cultivo celular
Software estadístico	Prisma GraphPad 7
Placa de 96 pocillos de fondo plano	sigma	CLS3922	cultivo celular
Incubadora de células	Sanyo	MIR-553
microscopio	Olimpo	CKX41