Detección de la activación del inflamasoma mediante microscopía de fluorescencia

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Cosecha de médula ósea

1. Extraiga asépticamente el fémur y la tibia de un ratón y limpie los huesos con instrumentos estériles. Colocar los huesos limpios en Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 5 mM de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (HEPES) + 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM de 2-mercaptoetanol + 50 mg/mL de sulfato de gentamicina + 10.000 U/mL de penicilina/estreptomicina + 10% de suero fetal bovino (FBS, DMEM-10 completo) e incubar el tubo en hielo durante 15 min.
2. Retire las rótulas proximal y distal con unas tijeras. Inserte una aguja de 25 g unida a una jeringa de 10 ml llena de medio en el hueco de los huesos. Enjuague la médula ósea con DMEM-10 completo. Vuelva a suspender los grumos pipeteando suavemente el medio hacia arriba y hacia abajo.
3. Centrifugar las células durante 10 minutos a 300 x g y contar el número de células con un hemocitómetro. En este punto, congele las células usando 90% de FBS + 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) o coloque las células en una placa de Petri de 15 cm para diferenciar los macrófagos usando medio acondicionado L929 (paso 2.1).

>2. Diferenciación de macrófagos derivados de la médula ósea

1. Utilizando un medio de diferenciación precalentado (21 mL de DMEM-10 completo y 9 mL de medio condicionado a células L929 según lo descrito por Swanson et al.), coloque células de médula ósea en una placa de Petri de 15 cm no tratada con cultivo de tejidos (1,2-1,5 x 10⁷ células). Incubar la placa a 37 °C y 5% de dióxido de carbono, o CO₂ durante 7 días. Agregue 30 mL adicionales de medio de diferenciación a la placa el día 3 o 4.
   nota: Es importante no utilizar placas tratadas con cultivo de tejidos, ya que los macrófagos serán difíciles de desprender y cosechar.
2. Para recolectar macrófagos, lave la placa con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y agregue 20 mL de PBS frío + 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Incubar la placa a 4 °C durante 10 min. Recoja las células pipeteando el PBS + EDTA sobre las células y lavando la placa con 10 mL de PBS. Combine ambos lavados en dos tubos cónicos de 15 ml.
3. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min y resuspender las células en 10 mL de DMEM libre de rojo fenol + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM de 2-mercaptoetanol + 5% de FBS (DMEM-5) y contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador de Coulter. Mantenga las celdas en hielo durante el conteo.
4. Siembre los macrófagos en placas recubiertas de cultivo de tejidos a 2 x 10⁵ células/mL. Para experimentos de microscopía, siembre 1 mL de células en cubreobjetos en placas de 24 pocillos. Para los ensayos de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), siembre 100 μL de células en una placa de 96 pocillos. Para el ensayo de LDH, sembró 9 pocillos (3 pocillos sin tratar, 3 pocillos con controles de lisis al 100% y 3 pocillos para el estímulo experimental).
5. Centrifugar la placa de 96 pocillos durante 5 minutos a 300 x g para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente por todo el pocillo.
6. Incubar la placa durante la noche a 37 °C + 5% de CO₂ antes de iniciar el proceso de cebado.

3. Cebado

1. Reemplace el medio con medio fresco (DMEM-5) que contenga 100 ng/mL de lipopolisacárido o LPS (500 μL para la placa de 24 pocillos o 50 μL para la placa de 96 pocillos).
   nota: Hay una variedad de variaciones estructurales en LPS, que afectan la capacidad de estimular el cebado mediado por TLR4. El LPS de Salmonella minnesota R595 (Re) está disponible en varios proveedores y se recomienda.
2. Incubar la placa durante 3 h a 37 °C y 5% de CO₂.

>4. Activación del inflamasoma NLRP3 con nigericina y marcaje con FAM-YVAD-FMK

1. Retire el medio y reemplácelo con 290 μL de DMEM-5 que contiene 5 μM de nigericina y 5 mM de glicina. La glicina se añade para reducir la cantidad de lisis celular que se produce durante la activación de la caspasa-1. Incubar durante 60 min a 37 °C y 5% de_CO2. Utilice macrófagos de tipo salvaje y deficientes en caspasa-1 para asegurarse de que el marcaje observado sea específico para la caspasa-1.
2. Durante los últimos 45 minutos, añadir 10 μL de 30x FAM-YVAD-FMK, preparado según las instrucciones del fabricante.
3. Después de 60 minutos, retire el medio y lave las celdas tres veces durante 5 minutos cada una con 1 ml de PBS frío.
4. Añadir 250 μL de paraformaldehído al 2% a cada pocillo e incubar en hielo cubierto con papel de aluminio durante 30 min.
5. Durante los últimos 5 minutos, agregue 4 μL de tinción de ácido nucleico fluorescente de rojo lejano de 0,2 mM para marcar los núcleos. También se pueden usar 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) u otros colorantes para marcar el ADN.
6. Lave las células tres veces con 1 mL de PBS frío y monte los cubreobjetos en portaobjetos de microscopio utilizando un medio de montaje anti-decoloración de 7 μL. Deje que el medio de montaje se endurezca durante la noche antes de sellar el cubreobjetos al portaobjetos del microscopio con esmalte de uñas.
7. Obtención de imágenes de los macrófagos mediante microscopía confocal. Ex/Em para FAM-YVAD-FMK es de 492/520 nm y de 642/661 para la tinción de ácido nucleico fluorescente rojo lejano. Asegúrese de configurar el microscopio de manera que las células no tratadas no muestren ninguna tinción de fondo en el canal 488. De lo contrario, se detectará la tinción de fondo de FAM-YVAD-FMK y no la caspasa-1 activa real.

>5. Obtención de imágenes de macrófagos marcados por microscopía confocal

NOTA: Las células teñidas se pueden ver después de que se haya dejado curar durante la noche y se hayan sellado al portaobjetos del microscopio con esmalte de uñas. Aquí se describen las imágenes utilizando un microscopio confocal. Las células también se pueden ver mediante microscopía de fluorescencia estándar.

1. Coloque el portaobjetos con las células de control no tratadas en la platina del microscopio y enfoque el microscopio en las células.
2. Con la configuración de la tabla de consulta (LUT) del microscopio, ajuste el desplazamiento de modo que no haya tinción positiva de FAM-YVAD-FMK en las células no tratadas. Este proceso también se puede realizar utilizando macrófagos deficientes en caspasa-1.
   nota: El desplazamiento debe ajustarse para cada canal utilizado en el experimento, pero establecer el desplazamiento correcto es más crítico para el canal FAM-YVAD-FMK y los canales de anticuerpos fluorescentes. El desplazamiento del canal de ADN es menos crítico. Una vez que se haya establecido el desplazamiento, no ajuste esta configuración para el resto del experimento.
3. Cambie el portaobjetos a la muestra tratada con nigericina. Busque un campo que contenga celdas positivas y negativas para la tinción de FAM-YVAD-FMK. Ajuste el plano de imagen del canal FAM-YVAD-FMK al plano que tenga la mayor intensidad de tinción positiva. Normalmente, este será el plano en el que se obtiene la imagen del centro del foco del inflamasoma.
4. Ajuste la ganancia de modo que los focos sean visibles en las células que tienen núcleos condensados. Después de ajustar la ganancia y el desplazamiento, deje estos ajustes para el resto de la sesión de imágenes.
   nota: Una forma fácil de determinar si una célula es piroptótica es observando la morfología nuclear. Las células con caspasa-1 activa tienen núcleos redondeados y condensados, mientras que los nucleolos son visibles en las células sin activación de caspasa-1 y la morfología nuclear es similar a la de las células no tratadas.
5. Recopile imágenes de 5 campos seleccionados al azar con un aumento total de 100X. Normalmente, esto dará como resultado unas 40 celdas por imagen. Repita este proceso para cada muestra.
6. Cuente el número de celdas de cada imagen con un software de análisis de imágenes. A continuación, cuente el número de células que tienen una tinción FAM-YVAD-FMK positiva. Representa el nivel de activación de la caspasa-1 como el porcentaje de células positivas para FAM-YVAD-FMK.