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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Diferenciación de macrófagos derivados de la médula ósea
- Utilizando un medio de diferenciación precalentado (21 mL de DMEM-10 completo y 9 mL de medio condicionado a células L929 según lo descrito por Swanson et al.), coloque células de médula ósea en una placa de Petri de 15 cm no tratada con cultivo de tejidos (1,2-1,5 x 107 células). Incubar la placa a 37 °C y 5% de CO2 durante 7 días. Agregue 30 mL adicionales de medio de diferenciación a la placa el día 3 o 4.
nota: Es importante no utilizar placas tratadas con cultivo de tejidos, ya que los macrófagos serán difíciles de desprender y cosechar.
- Para recolectar macrófagos, lave la placa con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y agregue 20 mL de PBS frío + 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Incubar la placa a 4 °C durante 10 min. Recoja las células pipeteando el PBS + EDTA sobre las células y lavando la placa con 10 mL de PBS. Combine ambos lavados en dos tubos cónicos de 15 ml.
- Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min y resuspender las células en 10 mL de DMEM libre de rojo fenol + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM de 2-mercaptoetanol + 5% de FBS (DMEM-5) y contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador de Coulter. Mantenga las celdas en hielo durante el conteo.
- Siembre los macrófagos en placas recubiertas de cultivo de tejidos a 2 x 105 células/mL. Para experimentos de microscopía, siembre 1 mL de células en cubreobjetos en placas de 24 pocillos. Para los ensayos de liberación de LDH, siembre 100 μL de células en una placa de 96 pocillos. Para el ensayo de LDH, sembró 9 pocillos (3 pocillos sin tratar, 3 pocillos con controles de lisis al 100% y 3 pocillos para el estímulo experimental).
- Centrifugar la placa de 96 pocillos durante 5 minutos a 300 x g para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente por todo el pocillo.
- Incubar la placa durante la noche a 37 °C + 5% de CO2 antes de iniciar el proceso de cebado.
>2. Cebado
- Reemplace el medio con medio nuevo (DMEM-5) que contenga 100 ng/mL de LPS (500 μL para la placa de 24 pocillos o 50 μL para la placa de 96 pocillos).
nota: Hay una variedad de variaciones estructurales en LPS, que afectan la capacidad de estimular el cebado mediado por TLR4. El LPS de Salmonella minnesota R595 (Re) está disponible en varios proveedores y se recomienda.
- Incubar la placa durante 3 h a 37 °C y 5% de CO2.
>3. Activación del inflamasoma NLRP3 con nigericina
- Retire el medio y reemplácelo con 290 μL de DMEM-5 que contiene 5 μM de nigericina y 5 mM de glicina. La glicina se añade para reducir la cantidad de lisis celular que se produce durante la activación de la caspasa-1. Incubar durante 60 min a 37 °C y 5% deCO2. Utilice macrófagos de tipo salvaje y deficientes en caspasa-1 para asegurarse de que el marcaje observado sea específico para la caspasa-1.
- Después de 60 minutos, retire el medio y lave las celdas tres veces durante 5 minutos cada una con 1 ml de PBS frío.
>4. Tinción de anticuerpos
NOTA: Para etiquetar las células con anticuerpos para detectar ASC, sembrar, cebar y exponer las células a la nigericina idéntica a la sección anterior. El procesamiento posterior es el siguiente:
- Lave las celdas tres veces durante 5 minutos cada una con 1 ml de PBS frío. Añadir 250 μL de solución de fijación y permeabilización. Incuba las células en hielo y cúbrelas durante 30 min.
- Lave los macrófagos tres veces durante 5 minutos cada una con 1 ml de tampón de lavado.
- Añadir 250 μL de anticuerpo primario contra ASC diluido 1:500 en tampón de lavado e incubar durante 1 h en hielo. Incluya un cubreobjetos que no reciba ningún anticuerpo primario, sino que solo reciba el secundario. Este cubreobjetos se utilizará durante la configuración del microscopio para establecer el desplazamiento correcto.
- Lave las celdas tres veces durante 5 minutos cada una con 1 ml de tampón de lavado.
- Añadir 250 μL de anticuerpo secundario (colorante fluorescente conjugado cabra-anti-ratón) diluido 1:500 en tampón de lavado e incubar durante 1 h en hielo. Agregue 4 μL de tinción de ácido nucleico fluorescente rojo lejano de 0,2 mM durante los últimos 5 minutos de esta incubación para marcar los núcleos.
- Lave las células 3 veces con 1 ml de tampón de lavado en frío y monte los cubreobjetos en portaobjetos de microscopio utilizando un medio de montaje antidecoloración de 7 μL. Deje que el medio de montaje se endurezca durante la noche antes de sellar el cubreobjetos al portaobjetos del microscopio con esmalte de uñas transparente.
- Imagen de macrófagos por microscopía confocal. Ex/Em para el anticuerpo secundario es de 555/580 nm y de 642/661 para la tinción de ácido nucleico fluorescente de rojo lejano.