Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa para detectar la muerte de macrófagos después de la exposición a nigericina

Resumen

Fuente: den Hartigh, A.B. et al., Detección de la activación del inflamasoma y la muerte celular piroptótica en macrófagos murinos derivados de la médula ósea. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra el ensayo de lactato deshidrogenasa para detectar la muerte de macrófagos mediada por inflamasoma. Los macrófagos se exponen al lipopolisacárido para el cebado, seguido de la exposición a la nigericina para causar la muerte celular inducida por el inflamasoma, que se determina mediante el ensayo de lactato deshidrogenasa.

Protocolo

1. Ensayo de liberación de LDH

NOTA: Para el ensayo de liberación de LDH, siembre las células en una placa de 96 pocillos. No retire el medio después de cebar.

1. Reemplace el medio con medio fresco (DMEM-5: 10 mL de DMEM libre de rojo fenol + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM de 2-mercaptoetanol + 5% de FBS) que contenga 100 ng/mL de LPS en pocillos que contengan células de macrófagos adherentes (500 μL para las placas de 24 pocillos o 50 μL para las placas de 96 pocillos)
   nota: Hay una variedad de variaciones estructurales en LPS, que afectan la capacidad de estimular el cebado mediado por TLR4. Se recomienda LPS de Salmonella minnesota R595 (Re).
2. Incubar la placa durante 3 h a 37 °C y 5% de CO₂.
3. Añadir 50 μL de DMEM-5 que contiene 10 μM de nigericina a los pocillos experimentales y 50 μL de DMEM-5 a los pocillos de control espontáneos y de lisis al 100%. Incubar durante 60 min a 37 °C y 5% de_CO2.
4. Después de 30 minutos, agregue 10 μL de tampón de lisis 10x a los pocillos de control de lisis al 100% y agregue 10 μL de DMEM-5 a los otros pocillos. Durante esta incubación, retire 1 vial de mezcla de sustrato (1,5 mL de sustrato liofilizado) y 1 alícuota de tampón de ensayo (~12 mL) del congelador y déjelos descongelar protegidos de la luz a temperatura ambiente><. nota: La mezcla de sustrato contiene una sal de tetrazolio (violeta de yodonitrotetrazolio), que se convierte en un producto de formazano rojo.
5. Después de los 60 minutos de incubación total, centrifugar la placa durante 5 minutos a 500 x g a 10 °C. Transfiera 50 μL del sobrenadante a una placa transparente de fondo plano. Durante este tiempo, agregue 12 ml de tampón de ensayo al vial de mezcla de sustrato e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de usar.
6. Añadir 50 μL de sustrato a cada pocillo e incubar durante 30 min en la oscuridad. Incluya pocillos de solo medio para valores en blanco. Revise la placa después de 15 minutos para asegurarse de que la señal no exceda el límite de detección del lector de placas.
7. Después de 30 minutos, agregue 50 μL de solución de parada (ácido acético 1 M) y mida el OD₄₉₀ con un lector de placas.
8. Calcule el porcentaje de lisis celular utilizando la siguiente fórmula:
   % citotoxicidad = ((experimental - espontáneo)/(máximo - espontáneo))×100
   Experimental: células tratadas con nigericina; espontáneo: células no tratadas; Máximo: células expuestas al tampón de lisis.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cytotox96 Ensayo de citotoxicidad no radiactiva	Fisher Científico	PR-G1780	Incluye mezcla de sustrato y tampón de ensayo; Formulaciones patentadas. La solución de parada es 1 M de ácido acético
DMEM, alto contenido de glucosa, sin glutamina, sin rojo de fenol	Invitrogen	31053028
PBS de Dulbecco, sin calcio, sin magnesio	Invitrogen	14190144
Suero fetal bovino, calificado, origen de EE. UU.	Invitrogen	26140079	Inactivado por calor a 55 °C durante 50 min
gentamicina	Invitrogen	15750060
LPS ultrapuro de Salmonella minnesota R595 (Re)	Lista de productos biológicos	434
Lector de placas Spectramax M3	Dispositivos moleculares	5000414
L-Glutamina	Invitrogen	21051024