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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Aislamiento de neutrófilos sanos
- Obtenga 20 mL de sangre periférica de un donante sano en dos tubos recubiertos de 10 mL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
- Coloque 10 mL de sangre en un tubo estéril de 50 mL y agregue solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta 32,5 mL.
- Agregue un gradiente de densidad (por ejemplo, Ficoll-amidotrizoaat) debajo de las celdas.
- Absorbe 14 mL de gradiente de densidad con una pipeta de 10 mL y un controlador de pipetas.
- Coloque la pipeta en la parte inferior del tubo de 50 ml.
- Retire el controlador de pipeta de la pipeta, permitiendo que el gradiente de densidad fluya fuera de la pipeta por gravedad hasta que se alcance el máximo por efecto capilar (quedarán 1-2 mL), sin usar el motor.
- Retire la pipeta colocando un pulgar encima de la pipeta, evitando así que el gradiente de densidad se escape durante la extracción de la pipeta.
- Girar los tubos durante 20 min a 912 x g y temperatura ambiente (RT) sin aceleración ni freno.
NOTA: Los glóbulos rojos (RBC) y los neutrófilos tienen una alta densidad y se encuentran en la parte inferior del tubo de 50 ml. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) están separadas y en la parte superior del gradiente de densidad como un anillo blanco. El plasma diluido en PBS estará por encima de los PBMC. Si es necesario, las PBMC se pueden aislar transfiriendo el anillo blanco a un nuevo tubo de 50 ml con pasos de lavado adicionales con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Retire con cuidado el anillo blanco que contiene PBMC primero, seguido de la eliminación del plasma diluido en PBS y, por último, la capa de gradiente de densidad tanto como sea posible.
- Para aislar los neutrófilos de la mezcla de neutrófilos/eritrocitos, lisar los eritrocitos con agua destilada fría y estéril.
- Tome una botella de agua destilada estéril fría y un matraz de PBS concentrado 10x de la nevera.
- Trabaje rápidamente para este paso. Agregue 36 mL de agua destilada estéril fría directamente sobre el pellet y mezcle una vez con cuidado. Agregue 4 mL de PBS 10x después de 20 s para hacer una solución isotónica. Mezcle una vez con cuidado.
- Tubo de centrifugado durante 5 min a 739 x g y 4 °C (para la eliminación de glóbulos rojos). Los neutrófilos estarán en la bolita blanca.
- Deseche con cuidado el sobrenadante. Vuelva a realizar el paso 1.6.2 y asegúrese de que el pellet esté suspendido correctamente.
- Tubo de centrifugado durante 5 min a 328 x g y 4 °C.
- Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 5 mL de PBS. Cuente los neutrófilos y manténgalos en hielo.
NOTA: El rendimiento esperado de 1 tubo de sangre (10 mL) es de aproximadamente 15-75 millones de neutrófilos.
>2. Marcaje de neutrófilos con glóbulos rojos fluorescentes
- Haga una suspensión de neutrófilos de 10 a 20 millones de neutrófilos en 2 mL de PBS en un tubo de 15 mL.
- Haga una solución de 2 mL de PBS con 4 μL de enlazador de glóbulos rojos fluorescentes de 2 μM (consulte la Tabla de materiales) en un tubo diferente de 15 mL. Agregue esto suavemente a la suspensión de neutrófilos y mezcle con cuidado.
- Incubar en la oscuridad durante exactamente 25 minutos a 37 °C para marcar los neutrófilos con el enlazador de glóbulos fluorescentes rojos.
- Inactive el etiquetado agregando el medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor a RT hasta 15 mL y mezcle una vez cuidadosamente. Asegúrese de que el pellet se resuspenda con cuidado si se ha formado un pellet.
- Tubo de centrifugado durante 5 min a 328 x g y RT.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 5 mL de medio RPMI 1640 sin rojo de fenol que contenga 2% de FBS y 10% de penicilina/estreptomicina (P/S) en RT. Cuente los neutrófilos.
nota: Puede ocurrir una pérdida celular del 50% después del marcaje de glóbulos rojos fluorescentes.
>3. Inducción de la formación de trampas extracelulares de neutrófilos
- Hacer una suspensión celular de 0.42 x 106 celdas/mL en medio RPMI 1640 libre de rojo fenol que contenga 2% de FBS y 10% P/S.
- Agregue 37.500 neutrófilos en 90 μL por pocillo en una placa negra de fondo plano de 96 pocillos.
- Añadir 10 μL del estímulo elegido (por ejemplo, suero de un paciente) por triplicado hasta alcanzar una concentración del 10% en el pocillo. Incluya siempre un control negativo (medio) por triplicado.
- Incubar en la oscuridad a 37 °C durante el tiempo deseado, que oscila entre 30 min y 2, 4 o 6 h. Se sugiere incubar durante 4 horas.
- Calcule el volumen necesario para agregar 25 μL de colorante de ADN impermeable de 5 μM (ver Tabla de Materiales), para alcanzar una concentración final de 1 μM en el pocillo. Realizar una predilución, si es necesario, en medio RPMI 1640 que contenga 2% de FBS y 10% de P/S para obtener una concentración de 5 μM.
- Añadir 25 μL de colorante de ADN impermeable de 5 μM 15 min antes del final del tiempo de incubación. Continúe la incubación durante otros 15 minutos a 37 °C en la oscuridad.
- Retire el sobrenadante (~125 μL) con mucho cuidado y guárdelo si es necesario. Añadir 100 μL de paraformaldehído (PFA) al 4%. Manténgalo en la oscuridad e inmediatamente continúe con el paso 4.
>4. Visualización de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) con microscopía confocal de inmunofluorescencia 3D de alto contenido y alta resolución
- Configure los ajustes en el microscopio confocal de inmunofluorescencia haciendo clic en Configuración de adquisición.
- Haga clic en la pestaña Configurar.
- Selecciona el objetivo y la cámara. Elija el objetivo 10X Apo Lambda con un modo de adquisición de un agujero confocal de 60 μm.
- Haga clic en Placa y elija la placa de plástico de 96 pocillos. Seleccione los sitios que desea visitar y elija un número fijo de sitios. Rellene 3 columnas y 3 filas sin superposición (0 μm), que cubren un total del 45% del pocillo.
- Haga clic en Adquisición. Seleccione Habilitar enfoque basado en láser. Seleccione Adquirir serie Z/serie temporal si es necesario.
- Haga clic en Enfoque automático del sitio.
- Haga clic en Enfoque en la parte inferior de la placa | Desplazamiento por el grosor de la parte inferior. Para el pocillo inicial para encontrar la muestra, elija el primer pocillo adquirido. Para el enfoque automático del sitio, elija todos los sitios.
- Haga clic en Longitudes de onda.
- Para el número de longitudes de onda, elija 2. Para el nivel de refinamiento de la corrección de sombreado TL, elija 2.
- En Longitud de onda 1, seleccione Texas Red.
- Para las opciones de enfoque automático, seleccione láser con desplazamiento Z, desplazamiento posterior al láser de 1,1 μm. Utilice la pila Z con un rango personalizado de 200-10.
- Para Longitud de onda 2, seleccione isotiocianato de fluoresceína (FITC).
- Para las opciones de enfoque automático, seleccione láser con desplazamiento Z de w1 0 μm. Utilice Z-stack con un rango personalizado de 200-10.
- Para las opciones de adquisición, seleccione la serie Z y el máximo de imagen de proyección 2D. Para las opciones de adquisición, seleccione Corrección de sombreado | Apagado.
- Seleccione Serie Z. Seleccione el número de pasos: 10. Seleccione el tamaño del paso: 3 μm (el rango total será de 27 μm).
- Coloque la placa en la microscopía confocal de inmunofluorescencia.
- Haga clic en la pestaña Ejecutar.
- Complete el nombre y la descripción de la placa y elija la ubicación de almacenamiento.
- Seleccione los pozos que se deben adquirir.
- Elija el tiempo de exposición para Texas Red y FITC.
- Haga clic en Adquirir placa para iniciar la adquisición, que tomará aproximadamente 1 h por placa.
>5. Análisis de la formación de NET
- Utilice un programa de procesamiento de imágenes diseñado para el análisis de imágenes científicas multidimensionales (consulte la Tabla de materiales) para analizar la formación de NET.
- Transfiera los datos de imagen adquiridos a un disco duro separado.
- Seleccione la herramienta de adición de color.
- Seleccione w1 y elija la carpeta del disco duro donde se almacenan los datos.
- Seleccione w2 y elija la carpeta en el disco duro donde se almacenan los datos.
nota: Utilice una macro estándar que utilice w1 en el nombre del archivo para añadir color rojo a las imágenes Texas Red y utilice w2 para añadir color verde a las imágenes FITC.
- Seleccione Macro de análisis.
- Seleccione w1 y elija el valor de umbral (umbral de intensidad), que suele ser 10. Seleccione el valor de píxel deseado (umbral de tamaño, por ejemplo, 100).
- Seleccione w2 y elija el valor de umbral (umbral de intensidad), que suele ser 10. Seleccione el valor de píxel deseado (umbral de tamaño, por ejemplo, 500).
- Elija el destino del archivo de hoja de cálculo, ejecute el análisis y guarde los archivos de registro después.
- Analice los datos en una hoja de cálculo.