Aislamiento de lípidos de neutrófilos derivados de la sangre humana por separación bifásica

Resumen

Fuente: Brogden, G., et al. Métodos para estudiar las alteraciones lipídicas en neutrófilos y la posterior formación de trampas extracelulares de neutrófilos. J. Vis. Exp. (2017)

Este video muestra el aislamiento de lípidos de neutrófilos humanos mediante un sistema de solvente bifásico que utiliza metanol y cloroformo.

Protocolo

1. Aislamiento de lípidos y análisis de neutrófilos derivados de la sangre humana

1. Tome neutrófilos y colóquelos en hielo.
2. Sobre el hielo, pipetear los neutrófilos (presentes en la solución de metanol y cloroformo) en un tubo de vidrio con tapón de rosca de 15 mL con un sello de politetrafluoroetileno (PTFE) y homogeneizarlos agitándolos durante 1 min. Utilice tubos de vidrio para evitar que los lípidos se adhieran a las superficies de plástico. Utilice tapas de PTFE para evitar la contaminación por caucho/plástico.
3. Añadir 2 mL de metanol seguido 1 min después por 1 mL de cloroformo. Agitar de nuevo durante 1 min.
4. Gire los tubos de vidrio a RT y 50 rpm durante 30 min.
5. Granular la fracción proteica centrifugando la solución a 7 °C y 1.952 x g durante 10 min.
6. Decanta cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo de vidrio con tapón de rosca de 15 mL, dejando atrás la pastilla que contiene proteínas. Almacene el pellet a -20 °C para su posterior cuantificación.
7. Añadir 1 mL de cloroformo, esperar 1 min, añadir 1 mL de agua bidestilada e invertir el tubo de vidrio con tapón de rosca con la muestra durante 30 s.
8. Centrifugar a 7 °C y 1.952 x g durante 10 min y desechar la fase superior, hasta la capa turbia, pero sin incluirla.
9. Si es necesario, realice un paso de purificación adicional opcional repitiendo el paso 1.1.8.
10. Seque las muestras en un concentrador de vacío a 60 °C y guárdelas a -20 °C hasta que sea necesario.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 10 μl	Hamilton	701 NR 10 μl
Cánula 26G	Braun	4657683
cloroformo	Carl Roth	7331.1
metanol	Carl Roth	7342.1
Agua	Carl Roth	3255.1	Libre de endotoxinas