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1. Verificación de la infección
NOTA: Utilizando un ensayo de citotoxicidad, se puede medir la competencia de la infección. El siguiente protocolo destacará la aplicación de un producto de citotoxicidad para medir la liberación de LDH (lactato deshidrogenasa). También se pueden utilizar otros productos de citotoxicidad
- Preparación de la infección por C. neoformans en células de macrófagos
- Preparación de células fúngicas
- Usando un caldo de glicerol, escurre la cepa de C. neoformans de tipo silvestre (H99) en una placa de agar peptona dextrosa (YPD) de extracto de levadura para aislar colonias individuales.
- Incubar durante la noche durante 16 h a 37 °C en una incubadora estática.
- Seleccione una sola colonia de cepa silvestre de C. neoformans y cultive en 5 mL de caldo YPD en un tubo de ensayo de 10 mL con tapa suelta. Realizar en cuadruplicado.
- Incubar durante la noche durante 16 h a 37 °C en una incubadora agitadora a 200 rpm.
- Al día siguiente, los subcultivos se cultivan durante la noche en una dilución 1:100 en caldo YPD de 3 mL.
- Mida los valores de densidad óptica (OD600 nm) del cultivo de hongos para determinar la fase logarítmica media. Dependiendo del espectrofotómetro, la cepa de tipo silvestre de C. neoformans alcanza la fase de registro medio comúnmente después de 6 a 8 h de incubación en YPD con valores generales deOD de 600 nm que oscilan entre 1.0 y 1.5.
- Una vez que las células alcancen la fase de registro medio, tome una alícuota de 10 μL de suspensión de células fúngicas en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL y diluya 1:100 en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) 1x. Cuente el número de células con un hemocitómetro.
- Recoja y centrifugue las celdas a 1.500 x g durante 10 minutos, lave suavemente el pellet con PBS estéril a temperatura ambiente y repita durante un total de tres lavados.
- Resuspender las células en un medio de cultivo celular libre de antibióticos para lograr una concentración de 1,2 x 108 células/mL.
- Preparación de células de macrófagos
- Visualice cada pocillo en la placa de 6 pocillos para asegurarse de que las células hayan alcanzado el 70-80% de confluencia. Alternativamente, las células se pueden medir para obtener aproximadamente 1,2 x 106 células de macrófagos por pocillo.
- Calentar el medio suplementado con antibióticos a 37 °C antes del trabajo de cultivo celular. Asegúrese de que el entorno de trabajo esté esterilizado antes del trabajo de cultivo celular. Visualice las células con un microscopio óptico para asegurarse de que las células estén adheridas y sanas.
- Retire el medio de cultivo celular de la placa con una pipeta serológica o un aspirador de vacío.
- Agregue suavemente 5-7 mL de PBS (solución salina tamponada con fosfato) estéril a temperatura ambiente al plato de 60 x 15 mm.
- Incline suavemente el plato para lavar las células adheridas.
- Cocultivo de células de C. neoformans y macrófagos
- Agregue 1 mL de las células resuspendidas de C. neoformans a 4 pocillos que contengan células de macrófagos.
nota: El número de placas necesarias deberá calcularse antes de comenzar el experimento. Agregue 1 mL de medio libre de antibióticos a los pocillos vacíos.
- Deje que las células incuben a 37 °C con 5% de CO2 durante 3 h.
- Retire el medio de cultivo celular de la placa con una pipeta serológica o un aspirador de vacío.
- Agregue suavemente 1 ml de PBS estéril a temperatura ambiente.
- Incline suavemente la placa para lavar las células extracelulares de C. neoformans no adheridas o no fagocitadas.
- Agregue 1 ml de medio libre de antibióticos a cada pocillo en la placa de 6 pocillos.
- Incubar las células a 37 °C con 5% de CO2.
- En puntos de tiempo seleccionados (por ejemplo, 1, 3, 6, 12 y 24 horas) recoja el sobrenadante para medir la liberación de LDH de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Al mismo tiempo, las células de macrófagos no infectadas se lisarán hasta un valor determinado para obtener la máxima citotoxicidad.
- Calcule la citotoxicidad de la siguiente manera:
