1. Cultivo bacteriano
- Generar cepas mutantes isogénicas que se utilizarán para el estudio del factor específico secretado de interés.
nota: Las GASM1T1 5448 cepas de Streptococcus utilizadas para estos experimentos incluyeron WT GAS', un mutante sagAΔ cat deficiente en SLS (abreviado en el texto como ΔsagA) y una cepa complementada sagA (abreviada en el texto como ΔsagA+sagA).
- Prepare durante la noche cultivos líquidos de cepas bacterianas de interés. Cultive cepas GAS M1T1 5448 en -10 ml de caldo Todd-Hewitt a 37 °C durante 16-20 horas antes de infectar las células humanas.
- Centrifugar los cultivos bacterianos durante la noche (2.400 rcf durante 10 min) y volver a suspender en medio bacteriano fresco.
nota: La resuspensión en el mismo volumen en el que se cultivaron los cultivos durante la noche (5-10 ml) generalmente produce una densidad óptica inicial deseable.
- Normalizar los cultivos bacterianos a concentraciones iniciales iguales diluyendo los cultivos resuspendidos en medio bacteriano adicional hasta obtener la misma densidad óptica a 600 nm (OD600) para todas las cepas que se van a probar (se recomienda OD600 de aproximadamente 1,0 para mayor comodidad)
nota: En estos estudios, se utilizaron cultivos bacterianos en fase estacionaria para infectar las células huésped inmediatamente después de la normalización. Sin embargo, dado que algunas cepas de bacterias salen de la fase estacionaria de forma no sincrónica, puede ser más apropiado comenzar las infecciones del huésped con cultivos en fase logarítmica si se determina que este es el caso de las cepas de interés.
- Antes de realizar un análisis adicional, realice un ensayo de recuento de colonias para determinar las unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro presentes en los cultivos iniciales, de modo que se pueda determinar la multiplicidad de infección (MOI), o la proporción de bacterias por célula huésped.
- Prepare diluciones seriadas de 1 ml de cultivos bacterianos que se hayan normalizado a la densidad óptica deseada en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o en un medio de crecimiento bacteriano apropiado (en estos estudios se utilizó caldo Todd-Hewitt). Prepare diluciones que van de 10-1 a 10-6 para producir al menos un juego de placas de agar con colonias contables (30-300 colonias). Realizar todas las diluciones por triplicado.
- Transfiera 100 μl de cada dilución seriada a una placa de agar que contenga el medio apropiado para las especies bacterianas que se están analizando.
nota: En estos estudios se utilizó agar Todd-Hewitt.
- Utilice un esparcidor bacteriano de vidrio o plástico para distribuir uniformemente la alícuota de 100 μl por toda la superficie de la placa de agar y continúe esparciendo hasta que el líquido haya sido absorbido por el agar. Realizar bajo llama utilizando una técnica estéril.
- Incubar las placas de agar a 37 °C durante la noche o hasta que aparezcan colonias contables.
- Cuente las colonias que crecen en cada placa y calcule las UFC/ml en el cultivo original mediante la siguiente fórmula: número de colonias x inverso del volumen de dilución/cultivo en serie sembrado en mililitros.
p. ej. (200 colonias x 1/10-5 dilución) / 0,1 ml plateado = 2,0 x 108 UFC/ml
>2. Cultivo de células huésped
- Obtenga una línea celular huésped adecuada para los análisis deseados.
nota: Para estos estudios se utilizaron queratinocitos epiteliales humanos HaCaT29, un amable regalo de V. Nizet.
- Mantenga las células HaCaT en placas de cultivo de 100 mm en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco con un 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor. Incubar a 37°C con 5% de CO2.
>3. Infección de la célula huésped con un sistema de inserción de membrana permeable
- Coloque las células en placas de cultivo de tejidos apropiadas y déjelas crecer hasta que alcancen el 90% de confluencia.
Nota: Las células HaCaT utilizadas en estos estudios suelen alcanzar la confluencia dentro de los 2-3 días posteriores a la siembra.
- Para la recolección de lisado (p. ej., análisis de señalización y ensayos de determinación de trifosfato de adenosina (ATP)), coloque células de HaCaT en placas de 6 pocillos a una densidad de siembra de aproximadamente 3 x 105 células/pocillo.
- Para los experimentos de imágenes de inmunofluorescencia, las células de placa en cubreobjetos de vidrio estéril dentro de placas de 6 pocillos a una densidad de siembra de aproximadamente 3 x 105 células/pocillo.
- Para los ensayos de permeabilización de membrana de homodímero de etidio y liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), coloque células de HaCaT en placas de 24 pocillos a una densidad de siembra de aproximadamente 5 x 104 células/pocillo.
- Inmediatamente antes del tratamiento, lavar las células con 1x PBS estéril.
- Aplique medio de crecimiento fresco a las células. Para las condiciones descritas aquí, aplique 2 ml de medio por pocillo para placas de 6 pocillos o 0,5 ml de medio por pocillo para placas de 24 pocillos. Si se están probando tratamientos farmacológicos, mezclar con medio fresco y aplicar durante este paso.
nota: Algunos ensayos pueden requerir medios alternativos. Por ejemplo, dado que el rojo de fenol y las concentraciones séricas altas interfieren con el ensayo de liberación de LDH, para estos experimentos se utilizó DMEM sin rojo de fenol suplementado con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (p/v), 2 mM de L-glutamina y 1 mM de piruvato de sodio.
- Después de aplicar el medio fresco, coloque con cuidado un inserto de membrana permeable estéril de 0,4 μm en cada pocillo. Realice este paso en una campana de flujo laminar y use pinzas estériles para transferir el inserto de membrana permeable a cada pocillo.
- Aplique medio de cultivo celular fresco a la cámara superior de cada pocillo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para las condiciones descritas aquí, aplique 1 ml de medio por pocillo para placas de 6 pocillos o 0,1 ml de medio por pocillo para placas de 24 pocillos.
- Aplique un volumen adecuado de cultivos bacterianos normalizados (ver sección 1) a la cámara superior del sistema de inserto de membrana permeable. Utilice un medio bacteriano para tratamientos de control no infectados. Para obtener los resultados aquí descritos, agregue 25 μl de los cultivos normalizados por cámara para placas de 24 pocillos y 100 μl de los cultivos por cámara para placas de 6 pocillos><.
Nota: En estos estudios, se aplicó GAS de tipo salvaje o mutante a las células huésped con un MOI de 10. El MOI se calculó sobre la base del número final de células eucariotas (por ejemplo, 2 x 106 células/pocillo), de modo que se añadieron 10 veces más bacterias por célula huésped al comienzo del período de infección (por ejemplo, 2 x 107 UFC por pocillo). El MOI apropiado variará con las diferentes especies bacterianas y con los análisis de seguimiento deseados.
Nota: Además de usar medio bacteriano para controles no infectados, otros controles útiles para ciertas aplicaciones de esta técnica pueden incluir bacterias muertas por calor o medio bacteriano gastado para comparar.
- Incubar las células infectadas a 37 °C con 5% de CO2.
>4. Recogida de muestras
- Para recolectar medio de cultivo celular, lisados de células huésped o cubreobjetos de vidrio con células intactas para análisis de seguimiento, comience retirando cuidadosamente el inserto de membrana permeable con pinzas estériles.
- Para la evaluación de los lisados de células huésped:
- Aspire suavemente el medio por encima de la monocapa de células huésped. Evite alterar la monocapa, ya que esto puede provocar la pérdida de la muestra.
- Enjuague las celdas una vez con 1x PBS.
- Aspire suavemente el PBS. Aplique inmediatamente un volumen adecuado de tampón de lisis helado para lograr la concentración de proteína deseada e incube las muestras en hielo durante 15 minutos. Aplique entre 200 μl y 350 μl de tampón de lisis por pocillo de cada placa de 6 pocillos para lograr concentraciones de proteína entre 0,5 y 1,5 mg/ml.
Nota: El tampón de lisis utilizado en estos estudios estaba compuesto por agua desionizada, 1% (v/v) de sustituto Nonidet P40, un cóctel de inhibidores de la fosfatasa y un cóctel de inhibidores de la proteasa. Los reactivos específicos se enumeran en la sección Materiales y equipos.
- Utilice un raspador de células para separar las células de la superficie de la placa de cada pocillo y pipetear todo el contenido de cada pocillo en un tubo de 1,5 ml.
- Centrifugar muestras a 14.000 rcf durante 20 min a 4 °C.
- Para evaluar los componentes solubles del lisado, retire el sobrenadante a un tubo nuevo y guárdelo a -20 °C o utilícelo inmediatamente.
- Para evaluar los componentes nucleares u otros componentes de lisado insolubles, reserve el pellet y guárdelo a -20 °C o utilícelo inmediatamente.
