Extracción de lisado de células huésped de células huésped infectadas cultivadas en un sistema de membrana permeable

Resumen

Fuente: Flaherty, R. A., et al. Implementación de un sistema de infección basado en insertos de membrana permeable para estudiar los efectos de las toxinas bacterianas secretadas en las células huésped de mamíferos. J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra un sistema de inserción de membrana permeable para investigar el impacto de las toxinas bacterianas en las células huésped de manera controlada y aislada. Este enfoque permite la exposición selectiva de las células a las toxinas mientras se mantiene una separación física que imita la interacción natural huésped-patógeno.

Protocolo

1. Cultivo bacteriano

1. Generar cepas mutantes isogénicas que se utilizarán para el estudio del factor específico secretado de interés.
   nota: Las GASM1T1 5448 cepas de Streptococcus utilizadas para estos experimentos incluyeron WT GAS', un mutante sagAΔ cat deficiente en SLS (abreviado en el texto como ΔsagA) y una cepa complementada sagA (abreviada en el texto como ΔsagA+sagA).
2. Prepare durante la noche cultivos líquidos de cepas bacterianas de interés. Cultive cepas GAS M1T1 5448 en -10 ml de caldo Todd-Hewitt a 37 °C durante 16-20 horas antes de infecta....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Queratinocitos epiteliales humanos HaCaT			Regalo del laboratorio de Victor Nizet.
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)	Tecnologías de la Vida	11995-073	Utilice los medios apropiados para la línea celular de interés.
Suero fetal bovino (FBS)	Biooeste	S162H	Utilice aditivos de medios apropiados para la línea celular de interés.
Placas de cultivo de tejidos de 10 cm	Nunc	150350	Otras marcas son adecuadas.
Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos	CytoOne	CC7682-7506	Otras marcas son adecuadas, pero deben ser compatibles con el inserto Corning.
Insertos Transwell de 0,4 μm recubiertos de colágeno (6 pocillos)	Corning	3540
Insertos Transwell de 0,4 μm recubiertos de colágeno (24 pocillos)	Corning	3595
Raspadores de células	Marca Pescadora	08-100-241	Estos solo son necesarios para la recolección de lisados celulares.
Sustituto Nonidet P40	sigma	74385-1L	Otros proveedores son adecuados.