Detección de la adherencia bacteriana a las células huésped mediante imágenes de fluorescencia

Resumen

Fuente: Yang, J., et al. Detección automatizada y de alto rendimiento de la adherencia bacteriana a las células huésped. J. Vis. Exp. (2021)

Este video muestra el ensayo de adherencia bacteriana para evaluar la adherencia bacteriana marcada con GFP al cultivo de células epiteliales para estudiar la dinámica de las interacciones huésped-patógeno utilizando imágenes basadas en microscopía de fluorescencia.

Protocolo

1. Adherencia bacteriana y tinción de células huésped

1. En primer lugar, lave las monocapas de células A549 sembradas tres veces con PBS 1x tibio. Para cada lavado, agregue 100 μL de 1x PBS a cada pocillo, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces, deseche 1x PBS o espere 10 s después de la adición y luego aspire para eliminar 1x PBS. Para determinar la cinética de la asociación bacteriana, superponga las células con 100 μL de las concentraciones deseadas de suspensión bacteriana con diferentes MOI (0, 1, 10 y 100). Centrifugar las bacterias a 200 x g durante 10 min e incubar las células A549 infectadas a 37 °C, 5% de CO₂ durante 1 h.
   adicional nota: En este experimento, cada condición tenía un triplicado técnico.
2. Elimine las bacterias no unidas lavando las monocapas cinco veces con PBS tibio 1x como se describe anteriormente. Agregue 100 μL de formaldehído al 4% (en 1x PBS) en cada pocillo de las placas de 96 pocillos para fijar las celdas. Deje reposar las placas sobre hielo durante 15 minutos y luego lave la solución de fijación con 1x PBS tres veces.
3. Para teñir los núcleos, agregue 50 ng/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e incube durante 10 min en RT. Después de la incubación, lave los pocillos tres veces con 1x PBS. Cubra las células A549 infectadas con 100 μL de 1x PBS para evitar que se sequen. Procese para el siguiente paso o guarde la placa a 4 °C durante un máximo de 2 días en la oscuridad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Termo Fisher	62248	Tinte de tinción de células huésped
Placa de 96 pocillos	Corning	3882	Pozo de media área, fondo plano y claro
Celdas A549	ATCC	CCL 185	Línea celular de mamíferos
centrífuga	Eppendorf	5810R
OD600 DiluFotómetro	EL CASO
Caldo de soja típico	Células de cultivo	MBPE-4040
F-12k mediano	ATCC	302004	Medio de cultivo celular A549
Suero fetal bovino	Corning	35-016-CV