Una técnica de imagen para estudiar la respuesta del calcio en células infectadas por bacterias

Resumen

Fuente: Smail, Y., et al. Imaging Ca²⁺ Responses During Shigella Infection of Epitelial Cells. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra una técnica para detectar la respuesta local y global de iones de calcio tras la infección por Shigella de células epiteliales humanas. La Shigella invade las células huésped y libera efectores de invasión, lo que afecta los niveles de calcio intracelular. La amplitud y frecuencia del calcio citosólico local y global se estudian utilizando un indicador fluorescente.

Protocolo

1. Preparativos

1. Preparación de bacterias
   1. Colocar las bacterias (Shigella, cepa de tipo salvaje que expresa la adhesina AfaE (M90T-AfaE) en una placa de agar tripticasa de soja (TCS) que contenga 0,01% de rojo Congo (CR) e incubarlas durante 18 h a 37 °C.
      nota: Para aumentar su reproducibilidad, las placas de Shigella obtenidas en el paso 1.1.1 se almacenan a 4 °C y deben usarse dentro de una semana porque todas las colonias en el medio CR eventualmente se volverán rojas con el tiempo.
   2. Inocular el precultivo de caldo TCS seleccionando 3 colonias rojas de las placas de rayas.
      nota: Se realiza una inoculación con 3 colonias para limitar la probabilidad de elegir un solo clon cuyo plásmido de virulencia haya sufrido una recombinación genética.
   3. Cultive cultivos bacterianos líquidos en una incubadora agitadora durante 16 h a 37 °C a 200 rpm. Añadir ampicilina a una concentración final de 75 mg/mL. Las concentraciones de antibiótico no deben exceder 3 veces la concentración inhibitoria mínima, ya que un exceso de antibiótico puede conducir a la pérdida del plásmido de gran virulencia.
      nota: El mantenimiento del plásmido de virulencia de Shigella debe verificarse mediante la siembra de los cultivos bacterianos en placas de CR suplementadas con concentraciones adecuadas de antibióticos. La presencia de colonias blancas indica pérdida de plásmidos.
   4. Inocular el cultivo TCS con el precultivo bacteriano a una dilución de 1:100. Incubar a 37 °C en una incubadora agitadora durante 2 h a 200 rpm. Asegúrese de que la densidad óptica a 600 nm (OD_{600 nm}) sea de 0,2 a 0,4.
   5. Centrifugar el cultivo bacteriano durante 2 min a 13.000 x g a 21 °C y resuspender el pellet en un volumen equivalente de medio EM (120 mM de NaCl, 7 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl₂, 0,8 mM de MgCl₂, 5 mM de glucosa y 25 mM de HEPES, pH = 7,3).
   6. Diluir la suspensión bacteriana en un tampón EM a un diámetro exterior final de_{600 nm} de 0,1 y utilizarlo inmediatamente o almacenarlo a 21 °C y utilizarlo en los próximos 60 min.
2. Preparación de células
   1. Cultivar células HeLa en DMEM con 1 g/L de glucosa suplementada con un 10% de suero fetal de ternero (FCS) y cultivarlas a 37 °C con 10% de CO₂. Cultive TC-7 cultivado en DMEM con 4,5 g/L de glucosa, que contiene un 10% de FCS y aminoácidos no esenciales en una incubadora a 37 °C que contiene un 10% de CO₂.
   2. Para el mantenimiento de las células, divida las células regularmente para evitar una inhibición de contacto de crecimiento ligada a los estados confluentes; esto es crítico para una alta eficiencia de carga/transfección de la sonda de Ca²⁺.
   3. Coloque las células HeLa en cubreobjetos circulares estériles de 25 mm de diámetro en placas de 6 pocillos a una densidad de 3 x 10⁵ células/pocillo el día antes del experimento para las células HeLa.
   4. En el caso de las células TC-7, tripsinícelas y cuente. Siembrómelos en 4 x 10⁵ celdas/pocillo e incube durante 5 a 7 días a 37 °C en una incubadora de 10% de_CO2 antes de los experimentos para permitir la polarización.
      1. Refresque el medio de cultivo celular todos los días hasta el día del experimento.
         nota: Las cámaras desechables de 35 mm de diámetro con fondo de vidrio también se pueden utilizar como alternativa a los cubreobjetos que contienen cubreobjetos. Si se utilizan estos últimos, el control de la temperatura a través de una etapa u objetivo calentado no es suficiente, y se requiere una cámara de incubación con termostato montada en la platina del microscopio.
3. El día del experimento, retire el medio y lave las células 3 veces con 1 mL de medio EM a 21 °C.
4. Cargue las celdas con 3 mM de éster Fluo-4/acetoximetílico (Fluo-4-AM) en un tampón EM durante 30 min a 21 °C.
   nota: Si bien la carga de células HeLa subconfluentes no plantea problemas importantes, la carga de células TC-7 polarizadas suele ser heterogénea y poco eficiente. Para estas células, encontramos que la eficiencia de carga se ve mejorada por la adición del agente dispersante, ácido plurónico, a una concentración final de 0,1% y del inhibidor del transportador de aniones bromosulfoftaleína a una concentración final de 20 μM al EM que contiene Fluo-4-AM. El uso de sondas químicas radiométricas o sondas FRET codificadas genéticamente que requieren doble adquisición no es compatible con la velocidad de adquisición requerida para la obtención de imágenes de respuestas locales de Ca²⁺.
5. Lave las muestras 3 veces con tampón EM y luego incorpórelas en 1 ml de tampón EM a 21 °C para permitir la hidrólisis de la fracción AM. Utilice las pilas cargadas con Fluo-4 inmediatamente o dentro de los próximos 90 minutos (mantenidas a 21 °C).

>2. Infección y adquisición de imágenes de respuestas locales de Ca²⁺

1. Coloque el cubreobjetos que contiene las células cargadas con Fluo-4 en una cámara de imágenes o en una cámara con fondo de cristal. Lave las muestras en la cámara de imágenes o en la cámara desechable con fondo de cristal 3 veces con tampón EM para eliminar los compuestos que puedan resultar de la lisis celular. Agregue 1 mL de tampón EM.
2. Coloque la cámara en una platina de microscopio de fluorescencia invertida calentada a 33 °C.
   nota: Esta temperatura se selecciona como un compromiso entre las temperaturas óptimas compatibles con el proceso de invasión de Shigella y la ralentización de las respuestas de Ca²⁺ para visualizar las respuestas locales. Utilizamos un objetivo de aceite de inmersión 63X (NA = 1,25) equipado con anillos de contraste de fase.
3. Seleccione un campo de microscopía y configure los parámetros de adquisición, incluido el tiempo de exposición y el agrupamiento si es necesario, para optimizar la señal fluorescente Fluo-4.
   nota: Los principales desafíos de las imágenes locales de Ca²⁺ son la baja amplitud y la pequeña duración de las respuestas, que requieren una adquisición al menos cada 30 ms. Varios dispositivos de acoplamiento de carga multiplicadora de electrones retroiluminados disponibles en el mercado (EM-CCD) o cámaras complementarias de semiconductores de óxido metálico (C-MOS) presentan la sensibilidad necesaria para detectar respuestas locales de Ca²⁺ utilizando Fluo-4. La sensibilidad de detección también es un tema importante para limitar el fotodaño o artefactos, como las respuestas espontáneas relacionadas con la excitación fluorescente de Fluo-4 a alta frecuencia. En este caso, se utilizó una iluminación basada en LED de 470 nm, con un filtro de excitación de paso de banda de 480 ± 40 nm, un filtro dicroico de 505 nm y una emisión de paso de banda de 527 ± 30 nm utilizada al 5% de su intensidad máxima combinada con un filtro de densidad neutra de 1,0 para minimizar estos problemas bajo un flujo de adquisiciones de duraciones limitadas. Se realizó de forma rutinaria un análisis de las señales locales de Ca²+ por lotes de trenes de 120 s. Bajo estas condiciones de baja iluminación, no se observó fotoblanqueo de fluoróforos durante las adquisiciones de flujo de 2 min. Se pueden realizar adquisiciones sucesivas en la misma muestra, siempre que se utilicen campos diferentes. Como regla general, se realiza un primer flujo de adquisición en un campo de control en ausencia de estimulación bacteriana para garantizar la ausencia de respuestas espontáneas. Si se observan respuestas espontáneas, las muestras se lavan con tampón EM hasta que no se observen respuestas.
4. Para añadir bacterias a la muestra, se deben extraer 500 μL de tampón EM de la cámara y añadir 500 μL de la suspensión bacteriana preparada en el paso 1.1.6 para obtener un diámetro exterior final de_{600 nm} de 0,05, con el cuidado adecuado para evitar mover el campo de microscopía seleccionado; los volúmenes garantizan una mezcla adecuada de las bacterias y una distribución homogénea de las bacterias en las muestras celulares.
5. Realice una adquisición tras la adición de bacterias. Alternativamente, realice una adquisición 10 minutos después de la adición bacteriana, que corresponde al tiempo requerido para que las bacterias se sedimenten en las células en las condiciones utilizadas. Al final del flujo de adquisición, adquiera una imagen de contraste de fase del campo seleccionado para visualizar las bacterias que entran en contacto con las células y los pliegues de la membrana asociados con los sitios de invasión bacteriana.
6. Repita el procedimiento de adquisición como en el paso 2.5, a intervalos que sean adecuados a la duración de las adquisiciones de imágenes, el almacenamiento de archivos y la selección de un nuevo campo para cubrir todo el proceso.
   Nota: En el caso de Shigella, encontramos que los flujos de adquisición cada 5 min durante 20 min, después de la sedimentación bacteriana de 10 min, permitieron cubrir la mayoría de los eventos de invasión.
7. Al final del procedimiento de adquisición, añadir una concentración final de 2 μM de las muestras de ionomicina del ionóforo Ca²⁺ para determinar la amplitud máxima de las señales de Ca²⁺. Adquiera imágenes cada 3 a 5 segundos hasta la estabilización de la señal, generalmente durante menos de 10 minutos.
8. A continuación, añada el quelante Ca²⁺ etilenglicol-bis(β-aminoetílico éter)-N, N, N', ácido n'-tetraacético (EGTA) a una concentración final de 10 mM para determinar la señal de fluorescencia en ausencia de Ca²⁺. Adquiera imágenes cada 3 a 5 s hasta la estabilización de la señal, generalmente durante menos de 10 min.
   nota: Debido a la dinámica relativamente lenta de las variaciones globales de Ca²⁺, realice estas adquisiciones cada 3 a 5 s (no en modo de transmisión), lo que permite obtener imágenes de Ca²⁺ en el mismo campo microscópico durante los tratamientos sucesivos.

3. Análisis

1. Exprese las variaciones citosólicas de Ca²⁺ a lo largo del tiempo como el porcentaje de ΔF/F0, donde ΔF representa la variación de la intensidad de fluorescencia promedio de la región de interés (ROI) y F0 la fluorescencia de referencia en el mismo ROI, a la que se resta una región no relevante del campo desprovista de células.
   1. Eliminar los niveles de fluorescencia basal para cada célula en diferentes campos, correspondientes a los niveles de referencia; estos niveles pueden determinarse sin ambigüedades debido a la baja frecuencia y duración relativamente corta de las respuestas locales de Ca²⁺ en una adquisición de flujo dada.
      Nota: Cuantificar las características llamativas de las respuestas relacionadas con las preguntas formuladas y el modelo patogénico estudiado. Clásicamente, se tienen en cuenta varios parámetros para analizar las señales de Ca²⁺, incluida la frecuencia de las celdas que muestran respuestas locales o globales de Ca²⁺, así como la duración, amplitud y frecuencia de estas respuestas. En el caso de Shigella y las respuestas locales, otro aspecto importante del análisis es la asociación espacial de las respuestas con los sitios de invasión bacteriana.
2. Para cuantificar el porcentaje de celdas que responden mostrando respuestas globales o locales, dibuje ROI en celdas, en series de tiempo correspondientes a las variaciones de la intensidad de Fluo-4.
   1. Establezca parámetros estrictos para identificar las respuestas locales de Ca²⁺, como una amplitud tres veces superior a las variaciones de fondo de la línea de base de la intensidad de fluorescencia promedio de la celda, o una duración de al menos 200 ms, para evitar obtener un falso positivo.
      nota: Como regla general, incluso las respuestas locales pequeñas de Ca²⁺ se pueden distinguir de cualquier ruido de fondo por su perfil. Las ROI deben ser lo suficientemente grandes como para integrar suficientes señales de fluorescencia que permitan la detección de variaciones locales. Dependiendo de la intensidad de la detección de Fluo-4, estos ROI pueden corresponder a círculos con diámetros que oscilan entre 2 y 5 mM.
   2. Mida las variaciones de la intensidad promedio de fluorescencia de Fluo-4 en 2 regiones en un área distinta de la misma celda, para determinar si las respuestas son locales o globales.
      nota: El análisis de un gran número de células se facilita mediante el uso de software de imagen que permite la visualización en pantalla en línea de las variaciones de la intensidad media de fluorescencia a lo largo del tiempo para las regiones seleccionadas. El software de imágenes disponible en el mercado tiene esta opción, pero esto también se puede realizar utilizando el software gratuito Icy, utilizando el plugin ROI Intensity Evolution.
   3. Determine el porcentaje de celdas que muestran respuestas locales.
      nota: Este porcentaje se calcula a partir del número total de células analizadas en el campo de microscopía, que debe ser en número suficiente para soportar una significación estadística utilizando una prueba no paramétrica.
   4. Determine la duración de las respuestas locales.
      nota: Las respuestas locales de Ca²⁺ se pueden distinguir aún más de acuerdo con sus rangos de duración (es decir, menos de 500 ms, entre 5 y 10 s, o más de 10 s) y su asociación con sitios de invasión de Shigella.
3. Cuantificar la amplitud de las respuestas. En primer lugar, calibrar los niveles máximos de Ca²⁺ y de fondo de célula determinados en el paso 2.1.7. Dado que la carga de Fluo-4 puede variar para cada celda, realice estas determinaciones para celdas individuales en el campo.
   1. Expresa la amplitud de las respuestas como un porcentaje relativo de la respuesta máxima.
   2. Realizar pruebas estadísticas utilizando una prueba de normalidad, seguida de una prueba paramétrica para analizar las posibles diferencias en la amplitud de las respuestas entre muestras.
   3. Determinar la asociación de estas respuestas relativas a los sitios de invasión bacteriana por su respectiva localización a los fruncidos de membrana inducidos por bacterias visualizados en las imágenes de contraste de fase correspondientes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph versión 7.7	Imágenes universales
Sistema de iluminación CoolLED pE-2	Roper Científico
Microplato de 35 mm, de altura	IBIDI	81156
Caldo de tripticasa de soja (TCS)	Termopescador	B11768
Agar TCS	Termopescador	B11043
Rojo Congo	Sigma-Aldrich	75768
M90T-AFAE	Sun et al. 2017		Shigella flexneri serotipo V. que expresa la adhesina AfaE
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017		Cepa mutante isogénica ipgD que expresa la adhesina AfaE