>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación de pan-leucocitos
- Extraiga 1 mL de sangre periférica de un donante (o paciente) sano en una jeringa heparinizada. Asegúrese de contar con la aprobación del comité de ética responsable de la donación de sangre.
- Mezclar 1 mL de sangre periférica humana con 30 mL de tampón de lisis ACK (150 mM de NH4Cl, 1 mM de KHCO3 y 0,1 mM de EDTA, pH 7,0) en un tubo de 50 mL e incubar durante 8 min a temperatura ambiente.
- Llene los tubos con PBS y centrifugue a 300 x g durante 6 min. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 30 mL de tampón de lisis ACK.
- Repita los pasos 1.2 y 1.3 hasta que el sobrenadante esté claro. Finalmente, lavar las células en PBS, centrifugar a 300 x g durante 6 min a temperatura ambiente y volver a suspender el pellet de células en 2 mL de medio de cultivo (RPMI1640 + 10% FCS). Incubar las células a 37 °C durante 60 min.
>2. Carga de células Raji con SEB
- Prepare dos tubos Falcon de 15 mL con 1,5 x 106 células Raji por tubo. Centrifugar las celdas (300 x g durante 6 min a temperatura ambiente) y desechar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células en medio residual (alrededor de 50 a 100 μL), agregue 1,9 μL (1,9 μG) de SEB e incube a temperatura ambiente durante 15 min. Agregue 5 mL de medio de cultivo, centrifugue las células (300 x g durante 6 min a temperatura ambiente) y vuelva a suspender el pellet en medio de cultivo (RPMI1640 + 10% FCS) a una densidad de 1 x 106 células/mL.
>3. Inducción de sinapsis inmunitarias y protocolo de tinción
- Pipetear 500 μL de la preparación de células Raji cargadas con SEB en un tubo FACS y 500 μL de la preparación de células Raji descargadas en otro tubo FACS. Añadir 650 μL de pan-leucocitos a cada tubo y centrifugar las células (300 x g durante 10 min a temperatura ambiente). Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 150 μL de medio de cultivo (RPMI1640 + 10% FCS). Incubar a 37 °C (normalmente durante 45 min).
- Agitar suavemente las células (10 s a 1.000 rpm) y añadir 1,5 mL de paraformaldehído (1,5%) durante el vórtice para fijar las células. Detenga la fijación añadiendo 1 mL de PBS + 1% de BSA. Granule las células (300 x g durante 10 min a temperatura ambiente y vuelva a suspender el pellet de la celda en 1 mL de PBS + 1% BSA después de incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
- Pellet (300 x g durante 10 min a temperatura ambiente) y resuspender las células en 100 μL de PBS + 1% BSA + 0,1% saponina durante 15 min a temperatura ambiente para permeabilizar las células (placa de 96 pocillos, en forma de U).
- Lave las células en PBS + 1% BSA + 0,1% de saponina con centrifugación (300 x g durante 10 min a temperatura ambiente) y resuspenda el pellet celular en 50 μL de PBS + 1% BSA + 0,1% de saponina que contenga anticuerpos o compuestos marcados con fluoróforos (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150) y DAPI (1:3.000)).
- Incubar las células a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min. Lavar las células 3 veces añadiendo 1 mL de PBS + 1% de BSA + 0,1% de saponina. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células en 60 μL de PBS para la obtención de imágenes por citometría de flujo.
>4. Adquisición de imágenes mediante un citómetro de flujo
>NOTA: El siguiente procedimiento de adquisición de imágenes y análisis de datos se basa en la citometría de flujo de imágenes utilizando software como imagestream (IS100), INSPIRE e IDEAS. Sin embargo, también se pueden utilizar otros citómetros de flujo y software de análisis.
- Abra el software de análisis en la computadora conectada al citómetro de flujo de imágenes y haga clic en Initialize Fluidics en el menú Instrumento. Aplique las cuentas en el puerto derecho cuando se le solicite.
- Cargue la plantilla predeterminada desde el menú Archivo y haga clic en Ejecutar/Configuración. Selecciona Cuentas en el menú desplegable Ver.
- Ajuste el iluminador de campo claro haciendo clic en Establecer intensidad si el valor indicado es inferior a 200.
- Ejecute la rutina de calibración y prueba en la pestaña Asistencia haciendo clic en Iniciar todo.
- Haga clic en Vaciar/Bloquear/Cargar y aplique las muestras en el puerto izquierdo cuando se le solicite. Después de cargar las celdas en el citómetro de flujo, abra el clasificador de celdas y ajuste los valores de la siguiente manera: límite superior de intensidad máxima a 1.022 para cada canal, límite inferior de intensidad máxima a 50 para el canal 2 (DAPI) y el canal 5 (CD3-Pe-TxR), límite inferior de área a 50 para el canal 1 (dispersión lateral) y límite superior a 1.500.
- Cambie la potencia del láser de excitación a 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) y 647 nm (90 mW) en la pestaña Configuración.
- Cambie el menú desplegable Ver entre Celdas y Perlas para evaluar el clasificador de celdas y los ajustes de potencia del láser.
nota: Asegúrese de que todas las células y los pares de células se encuentren en la vista de celdas y que los grupos de células, los residuos y las imágenes con píxeles saturados se encuentren en la vista de residuos cambiando los clasificadores de células y/o las potencias del láser de excitación.
- Defina el nombre de la muestra y el número de imágenes que desea adquirir (15.000–25.000 para las muestras y 500 para los controles de compensación) en la pestaña Configuración. Haga clic en Ejecutar/Configuración para iniciar la adquisición.
