NOTA: Todas las técnicas de preparación del medio y cultivo celular se realizan en condiciones asépticas utilizando una cabina de bioseguridad con flujo laminar. Todos los pasos de incubación de cultivos descritos se llevan a cabo utilizando una incubadora diseñada para mantener una atmósfera de 37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad.
1. Cultivo celular
- Preparación del medio de crecimiento
- Para MSC (células madre mesenquimales) y LADMAC (macrófagos derivados de la médula ósea de ratón; se deriva de los nombres de los investigadores que establecieron la línea celular: Laskin, Dower y Malech), agregue 50 mL de FBS y 5 mL de mezcla antibiótica/antimicótica 100x a 500 mL de DMEM de alta glucosa (medio Eagle modificado de Dulbecco).
- Para los macrófagos (MΦ), añadir 50 mL de FBS, 100 mL de medio de condición LADMAC (preparado siguiendo los pasos de la sección 1.2) y 5 mL de mezcla de antibióticos 100x a 500 mL de DMEM.
nota: Las células LADMAC producen el factor estimulante de colonias (CSF-1) necesario para apoyar el crecimiento de las células MΦ.
- Propagar células en preparación para el cocultivo
- Para sembrar células MSC y MΦ a partir del stock congelado, equilibrar 9 mL de medio de crecimiento apropiado preparado en la sección 1.1 en cada una de las cuatro placas tratadas de cultivos celulares de 100 mm para cada tipo de célula y colocar en la incubadora de cultivos celulares durante 15 min.
- Mientras tanto, descongele rápidamente las alícuotas de 10a 6 células congeladas incubándolas en un baño de agua a 37 °C durante 2-3 minutos o hasta que se descongelen. A continuación, añada las células MSC descongeladas a 9 mL de medio de crecimiento MSC fresco y añada las células MΦ descongeladas a 9 mL de medio de crecimiento MΦ fresco en tubos cónicos estériles de 15 o 50 mL y centrifugue a 125 x g en un rotor de cubo oscilante durante 5 min.
- Aspire o decante el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet en 4 ml del medio de crecimiento fresco adecuado pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Añadir 1 mL de la suspensión de célula a cada una de las cuatro antenas de 100 mm para cada tipo de célula que se hayan equilibrado en el paso 1.2.1.
- Regrese los platos con celdas a la incubadora. Cambie el medio cada 2-3 días hasta que 70%-80% confluente.
>2. Semilla MSC en placas experimentales, Día 1
NOTA: Antes de sembrar el MSC, diseñe el diseño experimental de placa de 96 pocillos para espectrofotometría fluorescente y el portaobjetos de cámara para imágenes dinámicas. Para la placa de 96 pocillos, flanquee los pocillos experimentales con pocillos que contengan células, pero no las utilice en el ensayo. Marque al menos cuatro pocillos que se utilizarán para el blanco de reactivo (RBL). Consulte la Tabla 1 para ver un ejemplo de plantilla de 96 pocillos y la Tabla 2 para ver un ejemplo de una plantilla de portaobjetos de cámara de 4 pocillos. Se recomiendan placas negras o blancas de 96 pocillos con fondos transparentes. Un portaobjetos de cámara de vidrio de borosilicato de 1,5 mm es óptimo, pero el número de cámaras se puede ajustar según el diseño del estudio. En la Figura 1 se incluye un diagrama de flujo resumido de los métodos que siguen.
- Con una confluencia del 70%-80%, aspirar el medio de crecimiento de los cultivos en placas de 100 mm y añadir 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para aislar el MSC.
- Aspirar el PBS, añadir 2 mL de tripsina/EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) al 0,05% y colocarlo en la incubadora de cultivo durante 3-5 min.
- Después de 3 minutos, compruebe el desprendimiento de células con un microscopio invertido. Si las celdas están separadas, continúe con el siguiente paso; De lo contrario, continúe la incubación durante otros 1-2 minutos. No incubar más de 5-6 min.
- Agregue 5 mL de medio de crecimiento fresco al plato con las células desprendidas. Enjuague el plato con la mezcla de tripsina/medio y recoja las células en un tubo cónico limpio y estéril de 50 ml con una pipeta serológica estéril.
- Centrífuga durante 5 min a 125 x g. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 ml de medio de crecimiento fresco pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Para contar las células, agregue 10 μL de la suspensión celular a 30 μL de solución de azul de tripano al 0,4% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. A continuación, pipetee 10 μL de la mezcla bajo el cubreobjetos de una cámara de recuento de hemocitómetros.
- Usando un microscopio invertido o de campo claro, con el objetivo 10x, cuente las células no teñidas (viables) en cuatro de los cuadrados de 1 mm2. Calcule el número de celdas usando la fórmula: células/mL = recuento de células/# 1 mm2 cuadrados x factor de dilución x 104.
nota: Para este ejemplo, el número de cuadrados de 1 mm2 contados es cuatro y el factor de dilución es 4.
- Utilice la ecuación C1V1 = C2V2 para calcular y preparar una suspensión de 1 x 105 celdas/mL. Prepare 1 mL de celda/mL de suspensión para cada columna de la placa de 96 pocillos a llenar y 0.75 mL para cada cámara del portaobjetos de la cámara de 4 pocillos que se llenará de acuerdo con el diseño de la placa><.
nota: C1 = recuento de células, V1 = lo que se está calculando, C2 = 1 x 105, V2 = 5,50 mL.
- Determine V1 y réstelo de los 5,50 mL deseados del volumen total para determinar el volumen del medio fresco necesario para preparar la suspensión. Agregue el volumen de celdas (V1) de la suspensión original al volumen del medio fresco para un total de 5.50 mL con 1 x 105 celdas/mL.
- Añada 100 μL de suspensión de 1 x 105 celdas/ml a cada pocillo de la placa de 96 pocillos según el diseño de la placa utilizando una micropipeta multicanal y 530 μL a cada uno de los pocillos del portaobjetos de la cámara utilizando una micropipeta según el diseño de la placa. Incubar durante la noche.
nota: Para este experimento, las MSC se colocan en las columnas 1, 2, 3 y 6 de la placa de 96 pocillos (Tabla 1) y en los pozos 1 y 2 del portaobjetos de la cámara de 4 pocillos (Tabla 2). Por lo tanto, se preparan al menos 5,50 mL de una suspensión de 1 x 105 celdas/mL. La MΦ al 80% de confluencia se trata con mediadores inflamatorios el mismo día que se siembran las MSC en las placas experimentales.
>3. Aislar el MΦ y preparar los co-cultivos, Día 2
- Retire el medio de activación de las células MΦ y reemplácelo con 5 mL de medio de crecimiento fresco. Raspe suavemente con un elevador de células y recoja las células en un tubo cónico de 50 ml.
- Cuente las células utilizando la exclusión de azul de tripán y la hemocitometría como se describe para MSC en los pasos 2.6-2.7.
- Usando la ecuación en los pasos 2.8-2.9, prepare dos suspensiones separadas de 2 x 105 células/mL, una con células del control y otra con células de los cultivos MΦ tratados.
nota: Prepare 1 mL de celda/mL de suspensión para cada columna de la placa de 96 pocillos que se va a llenar y 0,75 mL para cada cámara del portaobjetos de la cámara de 4 pocillos que se va a llenar de acuerdo con el diseño de la placa.
- Aspire suavemente el medio de los pocillos experimentales de la placa de 96 pocillos que contiene MSC. Con una micropipeta multicanal, añada 100 μL de las suspensiones celulares MΦ tratadas y de control en los pocillos experimentales apropiados con y sin MSC de acuerdo con el diseño de la placa. Incubar durante la noche.
- Aspire suavemente el medio del portaobjetos de la cámara de 4 pocillos que contiene MSC y, con una micropipeta, añada 530 μL de suspensión de células MΦ a los pocillos adecuados según el diseño. Incubar durante la noche.
>4. Ensayo de fagocitosis, lectura de placa cinética fluorescente de 96 pocillos, día 3
- Ajuste de los parámetros del ensayo
- El día del ensayo, encienda el lector de placas fluorescentes y ajuste la temperatura del sistema a 37 °C.
- Abra el software System Pro y compruebe el icono del instrumento en la esquina superior izquierda para determinar si el instrumento está conectado al ordenador. Si el círculo rojo con una línea está visible, haga clic en el icono del instrumento y elija el instrumento en la ventana emergente para realizar la conexión.
- Seleccione Nuevo experimento para acceder a la ventana emergente del asistente de configuración de placas. En el menú Ayudante de configuración de placas, seleccione Configurar los ajustes de adquisición.
- Seleccione Monocromador en el menú de ajustes para la configuración óptica. Seleccione FL (fluorescencia) para el modo de lectura y Kinetic para el tipo de lectura.
- En la misma ventana de configuraciones, en Categoría, haga clic en Longitudes de onda y, a continuación, establezca los anchos de banda en 9 nm para la excitación y 15 nm para la emisión.
- Establezca el número de pares de longitudes de onda en 1. Ajuste las longitudes de onda LM1 a 510 nm para la excitación y a 540 nm para la emisión.
- Continúe por las categorías y seleccione Tipo de placa siguiente. Seleccione la opción que coincida con el tipo de placa que se está utilizando.
nota: Es importante que la selección coincida con el tipo de placa. Las alturas de lectura son establecidas por el sistema de acuerdo con la selección.
- A continuación, seleccione Área de lectura y resalte el área de la placa de 96 pocillos incluida en el diseño experimental.
- Seleccione PMT y óptica, establezca PMT Gain en High y Flashes per read en 6. Marque la casilla junto a Leer desde la parte inferior si usa una placa de fondo transparente.
- Seleccione Temporización y configúrelo en intervalos de 10 minutos durante un período de 70 minutos.
- Seleccione Agitar, marque la casilla Antes de la primera lectura y configúrelo durante 5 segundos. Marque la casilla Entre lecturas y configúrela durante 3 segundos. Establezca la intensidad de la vibración tanto para Bajo como para Lineal.
- Cierre la ventana. Cuando aparezca la ventana Ayudante de configuración de placas, seleccione Configurar el diseño de placas. Resalte los pocillos BL del diseño de la placa y haga clic en Placa en blanco.
- Resalte cada una de las filas experimentales, haga clic en Agregar, asigne un nombre al grupo y, a continuación, seleccione un color.
- En Opciones de asignación debajo del diseño de la placa, seleccione Serie y, a continuación, defina la serie en la ventana y haga clic en Aceptar. Repita para cada grupo.
- Prepara la suspensión de zymosan
- Mientras espera que la temperatura del sistema alcance los 37 °C, vuelva a suspender 1 mg de partículas de zimosano en 5 ml del medio de obtención de imágenes de células vivas.
- Agregue 1 mL de medio de imagen de células vivas al vial que contiene las partículas y recójalas en un tubo de cultivo de vidrio. Enjuague el vial con 1 ml adicional de solución de imagen y transfiéralo al mismo tubo de vidrio para asegurarse de que se transfieran todas las partículas. Agregue 3 mL de solución de imagen adicional para lograr 0.2 mg/mL de suspensión de partículas.
- Vórtice con pulsos rápidos durante 30-60 s. A continuación, utilice un sonicador de sonda para sonicar con 60 pulsos rápidos.
nota: Es muy importante crear una suspensión homogénea de partículas y no dejar que la suspensión se asiente demasiado tiempo antes de agregarla a los pozos experimentales. La aglomeración se repite rápidamente. Es posible que sea necesario optimizar la densidad de partículas por célula en función de la fuente, el tratamiento y la densidad de MΦ utilizados. En los estudios presentados se utilizaron partículas de zimosano conjugadas. Sin embargo, también están disponibles E. coli y S. aureus conjugados.
- Agregue zymosan y lea el plato
- Aspire el medio de los pocillos experimentales y enjuague 1 vez con 100 μL de la solución de imágenes de células vivas. Enjuague también los pocillos de RBL con la solución de imágenes de células vivas.
- Aspire la solución de imágenes de células vivas de pocillos experimentales y RBL y reemplácela con 100 μL de la suspensión de partículas de zymosan.
- Abra la bandeja de placas del lector fluorescente mediante la interfaz del panel táctil. Coloque el plato, sin la tapa, en la bandeja con el pozo A1 en la esquina superior izquierda. Cierre la bandeja con el panel táctil y haga clic en el botón verde Leer en el menú superior.
- Una vez finalizada la lectura, guarde el archivo en la carpeta correspondiente y exporte los datos en formato de hoja de cálculo haciendo clic en Archivo y seleccionando Exportar.
- Calcule la fluorescencia relativa media ± SEM para cada grupo replicado en cada punto de tiempo (10 min, 20 min, 30 min, etc.) en la hoja de cálculo (Archivo complementario 1) y transfiera los datos al software de gráficos.
- Utilice un formato de gráfico de líneas para presentar los datos y aplique ANOVA de dos vías (Tiempo x Tratamiento/MSC como factores) seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para determinar las diferencias entre los grupos individuales><.
nota: Mientras la lectura de la placa de 96 pocillos está en curso, prepare la placa de imágenes dinámicas para la adquisición de imágenes de lapso de tiempo. Asegúrese de que las imágenes dinámicas continúen con el análisis de un pozo experimental a la vez.
Tabla 1: Ejemplo de un diseño de placa de 96 pocillos. CBL - Celda en blanco; MSC - cabeza de serie día 1; MΦ+ tratado y MΦ sin tratar sembrado día 2; Se añadió blanco de reactivo RBL en el día 3 del ensayo.
| 1 | número arábigo | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| un | CBL (en inglés) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (en inglés) | RBL |
| B | CBL (en inglés) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (en inglés) | RBL |
| C | CBL (en inglés) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (en inglés) | RBL |
| D | CBL (en inglés) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (en inglés) | RBL |
| E | CBL (en inglés) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (en inglés) | RBL |
| F | CBL (en inglés) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (en inglés) | RBL |
| G | CBL (en inglés) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (en inglés) | RBL |
| H | CBL (en inglés) | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL (en inglés) | RBL |
Tabla 2: Ejemplo de un diseño de portaobjetos de cámara de 4 pocillos. MSC - plateado día 1; MΦ+ tratado y MΦ sin tratar plateado día 2.
| 1 | número arábigo | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
