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1. Electroporación
- Coloque 400 μl de suspensión celular en una cubeta preenfriada y agregue 20 μg de proteína seleccionada a la cubeta (50 μg/ml).
- Agite la cubeta suavemente ~ 10 veces para mezclar sin dañar las células. nota: La cubeta también se puede invertir varias veces para mezclar bien, pero no pipetee hacia arriba y hacia abajo ni haga vórtices para evitar dañar las células.
- Seque el exterior de la cubeta con una toalla de papel u otro limpiador para evitar arcos eléctricos en el electroporador.
- Muestra electroporada a 0.3 kV durante 1.5-1.7 mseg. Nota: Esto fue típico para este estudio.
- Inmediatamente después de la electroporación, agite la cubeta suavemente ~ 10 veces para mezclar bien.
>2. Enchapado de las células
- Guarde la cubeta con celdas electroporadas en hielo hasta que esté lista para colocarla en placas de recuperación.
- Para la mayoría de los análisis posteriores, lave las células 1 vez con NGM precalentado para eliminar la proteína efectora extraña.
- Retirar las células para su análisis y suspenderlas en 3-5 ml de NGM.
- Células de pellets por centrifugación a 900 x g durante 4 min.
- Vuelva a suspender en un volumen adecuado de NGM para el tamaño de placa deseado (por ejemplo, 2 ml para un plato de 35 mm).
- Retire la cantidad adecuada de celdas para el análisis posterior.
- Ejemplo 1: Placa en placas con fondo de vidrio para análisis de microscopía.
- Ejemplo 2: Placa en plástico de cultivo celular para análisis de proteínas, como purificaciones de afinidad.
- Permita que las células se recuperen en placas equilibradas en una atmósfera humidificada con un 95% de aire/5% de CO2 a 37 °C durante al menos 4 horas.
>3. Análisis de microscopía
- Fijación/tinción de inmunofluorescencia
- Lave las celdas 1 vez con PBS estéril después de un período de recuperación de 4 horas.
- Fije las celdas en metanol al 100% durante 2 minutos a temperatura ambiente. Utilice suficiente metanol para cubrir completamente las células (por ejemplo, 2 ml para un plato de 35 mm).
- Lavar 3 veces con PBS estéril.
- Permeabilice las células con Triton X-100 al 0,4% en PBS durante 15 min. Por ejemplo, use 1 ml para una placa de 35 mm de diámetro.
- Ajuste la longitud de permeabilización y la fuerza de Triton X-100 de acuerdo con el epítopo y la ubicación de la proteína objetivo. nota: Los mejores resultados deberán determinarse empíricamente para cada objetivo, sin embargo, las condiciones anteriores deben ser adecuadas para la mayoría de los objetivos citosólicos.
- Bloquear con 5% de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS durante 1 hora en RT. Por ejemplo, use 1 ml para una placa de 35 mm de diámetro.
- Lavar 3 veces con PBS.
- Incubar el anticuerpo primario en una solución de unión a anticuerpos (0,1% Triton X-100 y 1% BSA en PBS) durante la noche a 4 °C con un balanceo suave. Por ejemplo, utilice 0,5 ml para una placa de 35 mm de diámetro.
- Siga las recomendaciones del fabricante para la dilución de anticuerpos. nota: Por ejemplo, el anticuerpo de etiqueta peptídica de unión a estreptavidina (SBP-tag) se utilizó con una dilución de 1:1.000, mientras que el anticuerpo PKN1 se utilizó con una dilución de 1:200.
- Lavar 4 veces con PBS.
- Incubar con un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia adecuado en una solución de unión a anticuerpos durante 1 hora a temperatura ambiente, protegido de la luz.
- Por ejemplo, use Alexa 488 o Alexa 647 durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Siga las recomendaciones del fabricante para la dilución de anticuerpos. (por ejemplo, alrededor de 1:1,000 para este estudio).
- Agregue otras tinciones según sea necesario, por ejemplo, 5 μM de aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugada con Alexa 647 o DAPI según las recomendaciones del fabricante, durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar 5 veces con PBS y almacenar a 4 °C, protegido de la luz hasta que esté listo para tomar la imagen.