Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Cultivo de Malassezia en condiciones de laboratorio
NOTA: Guarde todos los reactivos y medios utilizados para este protocolo a temperatura ambiente (RT, 20 – 25 °C) a menos que se indique lo contrario, ya que la temperatura más baja puede inhibir el crecimiento de hongos.
- Prepare el medio Dixon modificado en líquido (mDixon) para el crecimiento de Malassezia. Para preparar 500 mL de medio mDixon líquido, disuelva 18 g de extracto de malta, 10 g de bilis de buey desecada, 5 mL de Tween-40, 3 g de peptona, 1 mL de glicerol y 1 mL de ácido oleico en 500 mL de H2O destilado (dH2O). Ajuste el medio a pH 6 con HCl y autoclave. Almacene el medio en RT.
- Prepare las placas de agar mDixon añadiendo 7,5 g de agar a 500 ml de medio mDixon antes de esterilizar en autoclave. Enfríe lentamente el agar mDixon después del autoclave utilizando una barra de dirección y una placa calefactora magnética para evitar la solidificación parcial del medio mientras se enfría.
- Una vez que el agar se haya enfriado a 50 – 60 °C, dispense el líquido en placas de Petri en una campana de flujo laminar y déjelas secar a RT durante la noche.
nota: Las placas de agar pueden almacenarse a 4 °C durante varias semanas cuando se envuelven y se mantienen boca abajo para evitar la evaporación.
- Obtener aislados de Malassezia y revivir las existencias liofilizadas de Malassezia de acuerdo con las instrucciones obtenidas por el proveedor.
- Inocular 10 mL de medio líquido mDixon en un matraz estéril Erlenmeyer de 100 mL con la suspensión de Malassezia revivida de acuerdo con las instrucciones obtenidas por el proveedor. Incubar el cultivo en una incubadora agitadora a 30 °C y 180 rpm.
- Inspeccione el crecimiento de la cultura Malassezia con regularidad verificando la apariencia de color crema y turbidez. La cinética de crecimiento depende de la especie y la cepa de Malassezia y puede ser particularmente lenta cuando Malassezia se revive recientemente a partir de una cepa liofilizada. (Figura 1A).
- Prepare las reservas de glicerol mezclando 3 partes del cultivo de Malassezia densamente cultivado en medio mDixon con 1 parte de glicerol estéril al 99%. Alicuóstate la mezcla de Malassezia/glicerol en tubos estériles con tapón de rosca y guárdala a -80 °C.
- Para la propagación in vitro, coloque Malassezia a partir del cultivo líquido en mDixon o del caldo de glicerol congelado en una placa de agar mDixon (llevada a RT desde 4 °C) utilizando un circuito de inoculación.
nota: Transfiera las placas de agar mDixon a RT desde 4 °C antes de su uso, ya que el agar mDixon frío inhibe el crecimiento de hongos.
- Incubar la(s) placa(s) de agar con Malassezia boca abajo en una incubadora aN (que no se agite) a 30 °C. Inspeccione regularmente el crecimiento de las colonias de Malassezia.
NOTA: Las colonias de Malassezia en placas de agar mDixon aparecen dentro de los 3 a 5 días y son de color crema opaco y lisas con elevación convexa (Figura 1B).
- Almacene las colonias de Malassezia en placas de agar mDixon en RT durante ~ 2 semanas. A continuación, prepare una nueva placa de agar mDixon rayando Malassezia del caldo de glicerol congelado como se describe en 1.7.
>2. Preparación del inóculo para la infección experimental por Malassezia en ratones
- Inocular 10 mL de medio mDixon líquido en un matraz estéril Erlenmeyer de 100 mL con 3 - 5 colonias individuales de Malassezia de una placa de agar mDixon (ver paso 1, Figura 1B).
- Incubar el cultivo de Malassezia durante ~ 48 a 96 h a 30 °C y 180 rpm hasta que el cultivo sea de color crema y turbio (Figura 1A).
nota: El tiempo necesario para el crecimiento de Malassezia depende de la especie y la cepa de Malassezia y de la cantidad de hongo utilizada para la inoculación.
- Transfiera 2 mL del cultivo de Malassezia a un tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL y centrifugue durante 1 min a 10.000 x g.
- Deseche el sobrenadante y lave el pellet suspendiéndolo en 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Vuelva a centrifugar durante 1 min a 10.000 x g.
- Después del lavado, suspenda el pellet en 1 mL de PBS mediante pipeteo vigoroso y mida la densidad óptica de la solución a 600 nm (ODA600) con un espectrómetro. Diluya la suspensión Malassezia 20 – 50 x con PBS para la medición del diámetro exterior para asegurarse de que la lectura esté entre 0,1 y 1,
nota: La densidad de un cultivo de 3 días de Malassezia varía generalmente entre 15 y 30 ODA600, dependiendo de la especie y la cepa de Malassezia y del número de células de levadura utilizadas para la inoculación del cultivo (paso 2.1). Malassezia tiende a formar agregados, por lo tanto, es necesario un pipeteo vigoroso para garantizar la homogeneidad de la suspensión.
- Alícuota un volumen de la suspensión de Malassezia en PBS que corresponde a una densidad de 4 ODA600 en un tubo estéril de 2 mL. Prepare 1 tubo por animal a infectar.
- Centrifugar los tubos que contienen Malassezia durante 1 min a 10.000 x g.
- Deseche el sobrenadante y suspenda el pellet de Malassezia en 200 μL de aceite de oliva autóctono (correspondiente a 2 células de levaduraOD A600/100 μl de aceite de oliva).
nota: Se descubrió que el aceite de oliva es un buen vehículo para la infección epicutánea por Malassezia, ya que Malassezia es una levadura lipofílica y dependiente de lípidos. El aceite de oliva es mejor absorbido por la piel que el PBS. Sin embargo, tenga en cuenta que no es fácil suspender Malassezia en aceite de oliva. Mejorar la suspensión de Malassezia/aceite de oliva mediante vórtice. Mantenga la suspensión en RT hasta que se use para la infección.
- Prepare tubos con aceite de oliva solo para simular la infección de los animales de control.
>3. Infectando ratones con Malassezia
- Ordene ratones hembra C57BL/6 a una edad de 6 a 8 semanas y permita que se aclimaten en la instalación de animales de experimentación durante al menos una semana. Calcule para 3 a 5 ratones por grupo, incluido un grupo de control no infectado.
- Prepare un cóctel anestésico estéril que contenga 1,3 mg/mL de xilacina y 6,5 mg/mL de ketamina en PBS. 5 mL del cóctel anestésico son suficientes para anestesiar a 20 animales. Ajustar el volumen del cóctel en función del número de animales a anestesiar.
- Anestesiar a los animales inyectando 10 μL/g de peso corporal de cóctel anestésico por vía intraperitoneal (correspondiente a 65 mg de ketamina y 13 mg de xilacina por kg de peso corporal) y colocar los animales anestesiados en una almohadilla térmica a 37 °C.
nota: A la dosis indicada, los animales generalmente permanecen anestesiados durante ~ 30 - 60 min.
- Compruebe los reflejos pellizcando el pie trasero con pinzas para asegurarse de que los animales están completamente anestesiados.
- Aplique una crema para los ojos en los ojos para prevenir la deshidratación durante la anestesia.
- Opcionalmente, mida el grosor de ambas orejas con un calibrador (rango de 0 a 5 mm). Mida dos áreas diferentes de cada oreja y calcule el grosor promedio de la oreja por oreja.
nota: La medición del grosor de la oreja es opcional y depende de la pregunta de investigación. Sin embargo, si el grosor de la oreja se utiliza como lectura de la inflamación de la piel, es necesario medir el grosor basal de la oreja antes de la infección. (consulte el paso 4).
- Opcionalmente, rompa la barrera epidérmica de la piel de la oreja dorsal mediante una leve extracción de la cinta: aplique manualmente un pequeño trozo de cinta sobre la piel y retírelo nuevamente. Repita durante 5 rondas consecutivas usando un trozo de cinta adhesiva nueva para cada ronda.
NOTA: Malassezia induce una inflamación cutánea más pronunciada en la piel con alteraciones de la barrera en comparación con la piel no perturbada (Figura 2A).
- Aplique tópicamente 100 μL (2 ODA600) de la suspensión de Malassezia/aceite de oliva en la cara dorsal de cada mazorca con una pipeta estéril. Incluya un grupo de control de animales que son tratados solo con aceite de oliva (grupo de control tratado con vehículo).
nota: Agite la suspensión de Malassezia/aceite de oliva vigorosamente para asegurar una suspensión homogénea de Malassezia inmediatamente antes de la aplicación.
- Deje a los animales anestesiados en la almohadilla térmica para evitar la hipotermia hasta que muestren signos de recuperación (movimiento de bigotes, aumento de la frecuencia respiratoria, etc.).
- Inyecte 200 μL de solución de glucosa al 2% estéril y precalentada por vía subcutánea en el pliegue nucal para apoyar su metabolismo y rehidratación.
nota: Para preparar una solución estéril de glucosa al 2%, disuelva 1 mg de glucosa en 50 ml de PBS y fíltrela con un filtro de 0,2 μm. La solución se puede almacenar a 4 °C.
- Transfiere a los animales de vuelta a su jaula.
>4. Análisis de la inflamación de la piel inducida por Malassezia
NOTA: Este procedimiento describe el análisis de la hinchazón del oído inducida por Malassezia durante la infección, que sirve como parámetro de la inflamación de la piel. Un requisito previo para analizar la hinchazón del oído inducida por hongos es medir el grosor basal del oído antes de la extracción de la cinta y/o la infección (Paso 3.5).
- Preparar la cámara de isoflurano para la anestesia a corto plazo de animales infectados y de control por Malassezia.
- Transfiera un animal a la vez a la cámara y espere a que el animal esté completamente anestesiado.
nota: Los signos de una anestesia adecuada incluyen la relajación completa del cuerpo, así como la respiración lenta y pesada (en los flancos). Controle cuidadosamente la anestesia, ya que la exposición prolongada al isoflurano puede ser mortal.
- Retire el animal de la cámara y colóquelo sobre un pañuelo de papel.
- Mida el grosor de la(s) oreja(s) con un calibrador (rango de 0 a 5 mm). Mida dos áreas diferentes de cada oreja y calcule el grosor promedio por oreja (consulte el paso 3.5).
- Transfiera al animal de vuelta a la jaula.
nota: La anestesia con isoflurano es de muy corta duración y los animales se recuperan dentro de ~ 30 s después de la extracción de la cámara de isoflurano.
- Calcule el aumento en el grosor de la oreja restando el grosor promedio de la oreja de referencia, medido antes de la extracción de la cinta y/o la infección, del grosor promedio de la oreja medido en cada momento después de la infección.
- Represente los valores calculados como el aumento del grosor de la mazorca o, alternativamente, como el grosor total de la mazorca a lo largo del tiempo para cada animal o grupo de animales (Figura 2B).
>5. Análisis de la carga fúngica en la piel infectada
- Prepare un tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL para cada mazorca que se vaya a recolectar, que contenga 0,5 mL de P40 (NP40) estéril al 0,05% nonidet (NP40) en dH2O y una bola de acero esterilizada en autoclave (5 mm de diámetro).
- Pesa los tubos con una balanza de precisión y anota el peso exacto.
- Eutanasia de los ratones por asfixia con CO2.
- Retire la(s) oreja(s) en la base y transfiérala al tubo que contiene 0,5 mL de NP40 estéril al 0,05% en dH2O, como se describe en los pasos 5.1 - 5.2.
- Pesa el tubo que contiene el tejido del oído y calcula el peso real de cada muestra restando el peso del tubo sin el órgano del peso del tubo con el órgano.
- Homogeneizar el tejido auditivo durante 6 min a 25 Hz utilizando un homogeneizador de tejidos. Asegurar que el tejido esté bien homogeneizado.
- Colocar 100 μL de cada muestra (correspondiente a 1/5 de cada homogeneizado, factor de dilución = 5) en placas de agar mDixon e incubar las placas boca abajo en una incubadora a 30 °C.
nota: La cantidad de homogeneizado plateado debe ajustarse de acuerdo con la carga fúngica que se espera. Asegúrese de colocar suficiente homogeneizado en placas para obtener al menos 10 y no más de 250 colonias por placa para permitir una fácil enumeración. Opcionalmente, coloque varias placas por muestra con diferentes diluciones de homogeneizado.
- Inspeccione regularmente el crecimiento de las colonias de Malassezia.
nota: Las colonias generalmente se vuelven visibles después de 2 a 3 días. El tiempo necesario para que crezcan las colonias de Malassezia depende de la especie y la cepa de Malassezia.
- Cuenta las colonias por plato.
- Calcule el número de unidades formadoras de colonias, UFC/g de tejido, utilizando la siguiente fórmula:
UFC/g tejido = (número de colonias/placa) x (factor de dilución) / (peso de la muestra de piel en g).
nota: El límite mínimo de detección aproximado puede evaluarse mediante la siguiente fórmula: límite mínimo de detección = (1 colonia/placa) x (factor de dilución) / (peso medio de todas las muestras de piel en g).
- Las cargas fúngicas generalmente se trazan en una escala logarítmica (Figura 2C).
