Un modelo de infección por macrófagos totalmente diferenciado de células derivadas de monocitos con Mycobacterium tuberculosis

Resumen

Fuente: Mily, A., et al. Polarización de células derivadas de monocitos humanos M1 y M2 y análisis con citometría de flujo tras la infección por Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp.(2020).

Este video muestra un método para estudiar las respuestas a la infección por Mycobacterium tuberculosis en macrófagos derivados de monocitos polarizados M1 y M2 humanos. El uso de la citometría de flujo permite el estudio de una variedad de marcadores de superficie asociados con poblaciones de macrófagos infectados y no infectados.

Protocolo

>1. Infección por Mtb de células derivadas de monocitos

NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en una instalación BSL-3.

1. Vuelva a suspender el pellet de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en un medio RPMI sin suero en un nuevo tubo estéril de 50 mL y ajuste la concentración bacteriana final a aproximadamente 5 x 10⁶ UFC/mL.
2. Retire el medio de cultivo celular de la(s) placa(s) de 6 pocillos que contienen células derivadas de monocitos. Agregue 1 mL de medio RPMI sin suero a cada pocillo. Añadir 1 mL de suspensión bacteriana por pocillo para obtener una multiplicidad de infección (MOI) 5:1, es decir, 5 x 10⁶ UFC por 10⁶ macrófagos en 2 mL/pocillo e incubar las placas durante 4 h a 37°C y 5% de CO₂.
3. Después de la infección, lavar las células 3 veces con 1 ml de tampón de lavado estéril para eliminar las bacterias extracelulares. Incline la placa y retire con cuidado todo el tampón de lavado de las esquinas. Vuelva a suspender las células derivadas de monocitos infectadas con Mtb en 2 mL de medio completo RPMI sin antibióticos y proceda a la tinción con citometría de flujo o incube las células durante otras 24 h (u otros puntos de tiempo) antes de la citometría de flujo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Portaobjetos de cámara de 8 pocillos	Lab-Tek	154534
RPMI 1640	Corporación de Tecnologías de la Vida	SH30096.01
IFN-γ	Peprotech	300-02
Na-piruvato	GE Healthcare Ciencias de la Vida	SH300239.01
L-Glutamina	GE Healthcare Ciencias de la Vida	SH30034.01
Placas de fondo plano Falcon de 6 pocillos	Ciencias de la vida de Corning	353046
Suero fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
GM-CSF	Peprotech	300-03