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>1. Infección por Mtb de células derivadas de monocitos
NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en una instalación BSL-3.
- Vuelva a suspender el pellet de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en un medio RPMI sin suero en un nuevo tubo estéril de 50 mL y ajuste la concentración bacteriana final a aproximadamente 5 x 106 UFC/mL.
- Retire el medio de cultivo celular de la(s) placa(s) de 6 pocillos que contienen células derivadas de monocitos. Agregue 1 mL de medio RPMI sin suero a cada pocillo. Añadir 1 mL de suspensión bacteriana por pocillo para obtener una multiplicidad de infección (MOI) 5:1, es decir, 5 x 106 UFC por 106 macrófagos en 2 mL/pocillo e incubar las placas durante 4 h a 37°C y 5% de CO2.
- Después de la infección, lavar las células 3 veces con 1 ml de tampón de lavado estéril para eliminar las bacterias extracelulares. Incline la placa y retire con cuidado todo el tampón de lavado de las esquinas. Vuelva a suspender las células derivadas de monocitos infectadas con Mtb en 2 mL de medio completo RPMI sin antibióticos y proceda a la tinción con citometría de flujo o incube las células durante otras 24 h (u otros puntos de tiempo) antes de la citometría de flujo.