Un ensayo para estudiar el papel de la vitronectina en la adherencia bacteriana a las células epiteliales del huésped

Resumen

Fuente: Singh, B. et al., Ensayos para estudiar el papel de la vitronectina en la adhesión bacteriana y la resistencia sérica. J. Vis. Exp. (2018)

En este vídeo, demostramos un ensayo para estudiar el papel de la vitronectina en la adherencia de Haemophilus influenzae a las células epiteliales del huésped.

Protocolo

1. Estudio de la adherencia dependiente de Vn de las bacterias a las células epiteliales

1. Cultivo de células A549 (células epiteliales alveolares tipo II) en un matraz de cultivo de tejidos de 75^cm2 con medio F12 suplementado con suero fetal de ternero (FCS) al 10% (vol/vol) (medio completo) y gentamicina 5 μg/mL. Incubar el matraz en una incubadora con 5% de CO₂ a 37 °C durante 3 días hasta que el 80% confluente (la confluencia se puede estimar visualizando la cobertura de la superficie de las células utilizando un microscopio invertido). En los cuatro pasos siguientes se describe cómo preparar las células epiteliales para el ensayo.
   1. Lave la monocapa celular en el matraz dos veces con 20 mL de PBS mediante un suave remolino. Para separar las células de la superficie del matraz, añadir 2 mL de solución enzimática de desprendimiento de células e incubar el matraz durante 5 min a 37 °C. Golpee el matraz con la palma de la mano para separar todas las células de la superficie de plástico. Pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces para dispersar los grupos de células.
   2. Añada 18 mL de medio completo F12 al matraz y transfiera toda la suspensión celular a un tubo Falcon estéril de 50 mL. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 200 x g a RT y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular en 10 mL de medio completo F12.
   3. Retire 10 μL de la suspensión celular y colóquela en un tubo Eppendorf, luego agregue 90 μL de solución de azul de tripano. Cargue la muestra en un hemocitómetro (profundidad 0,1 mm) después de colocar el cubreobjetos.
   4. Cuente todas las celdas viables en las áreas A, B, C y D (cada campo consta de 16 cuadrados y cada cuadrado tiene un área de 0,0025 mm²), luego calcule el número promedio de celdas ([A + B + C + D]/4). Calcule el número de celdas por mililitro usando la siguiente ecuación:
      Células viables/mL = recuento medio de células × 10^{4 ×} factor de dilución.
      nota: Aquí, el factor de dilución es 10.
   5. Diluir la suspensión celular a 5,0 x 10³ células/mL utilizando un medio completo que contenga 5 μg/mL de gentamicina. Dispense 500 μL de suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Incubar la placa a 37 °C con 5% de CO₂ hasta que las células estén confluentes en un 90%.
2. Antes de la infección bacteriana, retire el medio de los pocillos y agregue medio F12 (sin FCS), luego incube durante la noche a 37 °C.
3. Lavar la monocapa celular tres veces con 500 μL de PBS a RT. Colocar la placa sobre hielo y añadir 100 μL de medio F12 preenfriado que contenga 10 μg/mL de Vn. Incubar la placa a 4 °C durante 1 h. Para los pozos de control, agregue solo F12 medio.
4. Después de la incubación, deseche la solución por pipeteo y lave la capa celular dos veces con 1 mL de PBS en RT.
5. Cultivo de aislados clínicos de Hif en medio de infusión cerebro-corazón (BHI) suplementado con 10 μg/mL de NAD y hemina a 37 °C con agitación a 200 rpm. Utilice el medio Luria-Bertani para cultivar E. coli. Coseche Hif en la fase media del registro (OD600 = 0,3) y vuelva a suspender las bacterias en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2, que contenga 1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) (tampón de bloqueo; PBS-BSA). Ajuste la suspensión a 10⁹ UFC/mL. Vuelva a suspender un cultivo de Hif M10 recién crecido en medio F12 (2×10,⁸ UFC/mL). Añadir 100 μL de esta suspensión bacteriana a cada pocillo e incubar la placa durante 2 h a 37 °C.
   nota: Cada pocillo contiene aproximadamente 2 x 10⁵ células A549. Para la infección, se añadieron 2 x 10⁷ UFC bacterianas, correspondientes a una multiplicidad de infección de 100.
6. Retire el medio mediante pipeteo y lave las células epiteliales A549 tres veces con PBS. Añadir 50 μL/pocillo de solución de desprendimiento de células e incubar la placa durante 5 min a 37 °C.
7. A continuación, agregue 50 μL de medio completo F12 por pocillo para detener la reacción enzimática. Transfiera las células epiteliales (≈100 μL [es decir, todo el volumen]) de cada pocillo a un tubo de vidrio de 6 mL que contiene cuatro perlas de vidrio. Lisar las células en RT mediante vórtice durante 2 min.
8. Diluya 10 μL de la célula lisada 100 veces añadiendo 10 μL de lisado a 990 μL de medio F12. Coloque 10 μL de la muestra diluida en una placa de agar chocolate.
9. Incubar la placa de agar chocolate a 37 °C durante la noche, luego contar las colonias. Cada colonia representa una UFC.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml	Halcón BD	60819-138	Estilo de 12 × 75 mm
Incubadora suministrada con 5% deCO2	Termo Científico	BBD6220
Tubo de poliestireno de 6 ml de fondo redondo	VWR	89000-478	Estilo de 12 × 75 mm con tapa
Placas de 24 pocillos	Halcón BD	08-772-1H	Grado de cultivo celular
Matraz decultivo de tejidos de 75 cm 2	Halcón BD	BD353136	Ventilación
A549 Línea celular humana	Sigma-Aldrich	86012804-1VL
Enzima de desprendimiento celular (Accutase)	Sigma-Aldrich	A6964-500ML	Grado de cultivo celular
Albúminas séricas bovinas (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	Apto para el cultivo celular
F12 medio	Sigma-Aldrich	D6421	Grado de cultivo celular
Suero de ternera fetal (FCS)	Sigma-Aldrich	12003C	Apto para el cultivo celular
Hemotómetro	Marienfeld	640210
Matraz para cultivo de tejidos	Halcón BD	3175167	75 cm2
Vitronectina (Vn) a partir de plasma humano	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Grado de cultivo celular