Determinación del papel de la vitronectina en la resistencia bacteriana a la actividad bactericida del suero humano

Resumen

Fuente: Singh, B. et al., Ensayos para estudiar el papel de la vitronectina en la adhesión bacteriana y la resistencia sérica.J. Vis. Exp.(2018)

Este video demuestra el papel de la vitronectina, una glicoproteína sérica humana, en la resistencia bacteriana. Los anticuerpos en el suero interactúan con las proteínas de superficie bacterianas, activando las proteínas del complemento y formando el complejo de ataque a la membrana, causando la lisis celular bacteriana. La unión de la vitronectina a la proteína de la membrana bacteriana evita la formación del complejo de ataque de la membrana, lo que resulta en la supervivencia bacteriana.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

>1. Análisis de la resistencia dependiente de Vn a la actividad bactericida del suero humano

1. Compre suero humano normal (NHS, por sus siglas en inglés) de una fuente comercial. Prepare vitronectina o suero con depleción de Vn (VDS). Reponer el VDS con 180 nM Vn, que es equivalente al Vn presente en el NHS.
2. Preparar suero inactivado por calor (HIS) calentando NHS a 56 °C durante 30 minutos para inactivar las proteínas del complemento.
   nota: La concentración sérica óptima (5%) y el tiempo de incubación (15 min) para el ensayo se determinaron empíricamente para Haemophilus influenzae tipo f (Hif); Estos parámetros podrían variar para otros patógenos bacterianos.
3. Bacterias de cultivo (en este caso, Hif M10 y el mutante Hif M10Δlph) hasta la fase logarítmica media (OD₆₀₀ = 0,3). Pellet de bacterias por centrifugación a 3.500 x g durante 10 min.
4. Vuelva a suspender el pellet bacteriano con 1 volumen de tampón Veronal de gelatina de dextrosa (DGVB⁺⁺; pH 7,3) que contenga 2,5% (p/v) de glucosa, 2 mM de cloruro de magnesio, MgCl₂, 0,15 mM de cloruro de calcio, CaCl₂ y 0,1% (wt/vol) de gelatina.
5. Añadir 1,5 x 10^{3 unidades} formadoras de colonias (UFC) de bacterias a 100 μL de DGVB⁺⁺ que contenga un 5% de suero (NHS, HIS, VDS o VDS+180 nM Vn). Incubar la muestra a 37 °C durante 15 min con agitación a 300 rpm.
6. Retire una alícuota de 10 μL de la mezcla de reacción a los 0 min (muestra T,₀) y a los 15 min (muestra T,_t) y coloque en agar chocolate. Incubar la placa a 37 °C durante la noche.
7. Después de la incubación, cuente las colonias que aparecen en el plato. Calcule el porcentaje de bacterias muertas utilizando la siguiente ecuación: (unidad formadora de colonias o UFC en T_t)/(UFC en T₀) × 100.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de poliestireno de 6 ml de fondo redondo	VWR	89000-478	Estilo de 12 × 75 mm con tapa
Suero humano normal (NHS)	Complemento Tecnológico, Inc.	Nhs	Suero humano agrupado
Cloruro de calcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G
glucosa	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
gelatina	Sigma-Aldrich	G9391	Apto para el cultivo celular
Hemotómetro	Marienfeld	640210
Cloruro de magnesio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266-1KG
Vitronectina (Vn) a partir de plasma humano	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Grado de cultivo celular
sacudidor	Stuart Científico	STR6	Agitador de plataforma