Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Disección e infección de la mucosa cervical uterina
NOTA: Para obtener resultados óptimos, los explantes de mucosas cervicales deben procesarse e infectarse lo antes posible después de la cirugía, idealmente el mismo día de la cirugía. Alternativamente, las muestras pueden almacenarse sumergidas en CMT (medios de cultivo suplementados con antibióticos) a 4 °C durante la noche e infectarse inmediatamente después de la disección.
- Deje que el CM alcance el tiempo suficiente para alcanzar el RT o colóquelo en un baño de agua precalentado a 37 ° C. Complemente el CM con una solución antibiótica (CMT) antes de usar. Deseche cualquier solución antibiótica sobrante. Vierta la solución de etanol al 70% en un recipiente limpio para remojar las pinzas y el bisturí cuando sea necesario durante el procedimiento de disección. Limpie las herramientas y cambie la hoja del bisturí entre disecciones de muestras de múltiples donantes.
- Con pinzas estériles, transfiera la muestra del contenedor de transporte a una placa de Petri de 100 mm que contenga 10-20 mL de CMT.
- Usa la tapa de la placa de Petri como superficie de corte para diseccionar el tejido. Sujetando el tejido suavemente con pinzas, separe la mucosa del ectocérvix y/o endocérvix del tejido estromal y muscular inferior (submucosa) con un bisturí y una cuchilla para obtener tiras de mucosa.
nota: Al trabajar en una pieza de tejido, es importante mantener el resto del tejido sumergido en un medio para evitar la desecación del tejido.
- Corta la mucosa en tiras de 2 mm de ancho, y retira y desecha la mayor cantidad de submucosa posible, dejando solo una capa de tejido de 2 mm de grosor. Corta las tiras en bloques de 2 mm de grosor. Esto debería dar lugar a explantes de tejido de aproximadamente 8 mm3.
Precaución: La manipulación de herramientas afiladas para diseccionar muestras humanas aumenta el riesgo de lesiones y contaminación. El operador debe considerar el uso de guantes metálicos, de malla y resistentes a los cortes como protección adicional.
- Transfiera los explantes de tejido a una nueva placa de Petri de 100 mm que contenga 10-20 mL de CMT para evitar la desecación del tejido mientras se procede con la disección. Al final de la disección, agite la placa para aleatorizar la distribución del explante.
- Con pinzas estériles, transfiera los explantes a los tubos cónicos estériles de 1,5 ml (máximo 16 explantes por tubo). Retire cualquier medio del tubo con una pipeta.
- Descongelar el preparado de VIH-1 en un baño de agua a 37 °C. Si es necesario, diluya el caldo de virus con CM. Transfiera el virus al tubo o tubos que contienen los explantes. Deseche cualquier preparación de virus residual.
nota: El stock de virus debe diluirse de modo que el inóculo seleccionado esté contenido en un volumen mínimo de 0,5 mL (Tabla 1). Para reducir la variabilidad de los resultados entre experimentos independientes, se debe utilizar la misma preparación del virus para todo un estudio (Tabla de materiales).
- Transfiera los tubos a un termoagitador e incube durante 2 h a 37 ° C meciendo a 300 rpm. Invierta suavemente los tubos unas cuantas veces cada 30–60 min.
Nota: Para que la infección sea eficaz, es fundamental utilizar el tiempo mínimo necesario entre la descongelación de la preparación para el VIH-1 y la transferencia de las trompas a 37 °C.
- Llene una placa de 6 pocillos con 3-4 ml por pocillo de solución salina tampón de fosfato estéril (PBS). Al final de la incubación con VIH-1, deseche toda la preparación del virus en el tubo o tubos en un recipiente con una solución desinfectante utilizando una pipeta. Transfiera los explantes a la placa de 6 pocillos que contiene PBS usando fórceps.
- Deje reposar los explantes en PBS durante 1 minuto en RT, y luego lávelos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo el PBS en el pozo 2-3 veces. Deseche el PBS en un recipiente con una solución desinfectante con una pipeta. Agregue de 3 a 4 mL de PBS nuevo a cada pocillo. Repita dos veces más para un total de tres lavados. Deseche el PBS justo antes de transferir los explantes a las esponjas para evitar la desecación del tejido.
nota: Los explantes de la mucosa cervical, y en particular el endocérvix, liberan grandes cantidades de moco durante la infección. Es fundamental lavar y eliminar la mayor cantidad de moco posible, ya que la retención inespecífica en los explantes y la posterior liberación del virus en el sobrenadante del cultivo pueden enmascarar la replicación del virus.
- Con fórceps, transfiera de 5 a 8 explantes encima de cada esponja de gelatina en un plato de 12 pocillos. Regrese la placa a la incubadora.
- Depositar todos los residuos biológicos en contenedores opuestos de acuerdo con la normativa del instituto sobre la manipulación de productos biológicos peligrosos y la evaluación de riesgos específicos.
