Cuantificación de interferones bioactivos de tipo I mediante un ensayo reportero de fosfatasa alcalina embrionaria secretada

Resumen

Fuente: Bego, M. G. et al., Evaluación de la detección innata de células T CD4⁺ infectadas por VIH-1 por células dendríticas plasmocitoides utilizando un sistema de cocultivo ex vivo. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra el ensayo de fosfatasa alcalina embrionaria secretada utilizando células reporteras de interferón-α/β HEK-Blue para cuantificar los interferones de tipo I (IFN) liberados después de la estimulación de las células dendríticas plasmocitoides por las células T CD4⁺ infectadas por el VIH-1.

Protocolo

1. Medición de IFN bioactivo tipo I utilizando células reporteras HEK-Blue IFN-α/β.

>Nota: Estas células se generaron mediante la transfección estable de células HEK293 con los genes humanos STAT2 e IRF9 para obtener una vía de señalización de IFN tipo I completamente activa. También contienen el gen reportero de la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) bajo el control del promotor inducible de IFN-α/β ISG54. La estimulación de estas células con IFN tipo I activa la vía JAK/STAT/ISGF3 e induce la producción de SEAP.

1. Mantenga las células HEK-Blue IFN-α/β en DMEM suplementadas con un 10% de FBS. Póngalos a una densidad de 50.000 células por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos, con un volumen final de 180 μl.
2. Mezcle 220 μl de PBMC (diluidas a 850.000 células/ml) o 220 μl de células dendríticas plasmocitoides (pDC) (a una concentración comprendida entre 100.000 y 500.000 células/ml) con 30 μl de células T infectadas (diluidas a 10⁶ células/ml) por pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo en U.
3. Incubar los cocultivos a 37 °C y 5% de CO₂ durante 18-22 horas, y luego transferirlos a una placa de 96 pocillos con fondo en V. Centrífuga durante 5 min a 400 x g.
4. Añadir 20 μl de sobrenadante de cocultivo a cada pocillo por duplicado. Cada placa también requiere un conjunto de controles estándar internos (IFNα humano, concentración final de 100 U/ml a 2.500 U/ml). Incubar las placas a 37 °C y 5% de CO₂ durante 18-22 h.
5. Determine los niveles de actividad de la fosfatasa alcalina utilizando la solución QUANTI-Blue, que cambia de rosa a púrpura/azul en presencia de la enzima. Prepare QUANTI-Blue siguiendo las recomendaciones del fabricante. Agregue 180 μl de esta solución a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. A cada pocillo se añaden también 20 μl de los sobrenadantes inducidos de las células HEK-Blue IFN-α/β e incubar la placa en una incubadora a 37 °C hasta que se desarrolle el color en los pocillos de control estándar de IFN.
6. Evalúe los niveles de SEAP utilizando un espectrofotómetro a 620-655 nm y determine la concentración de IFN tipo I por extrapolación de la parte lineal de la curva estándar de IFN.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células MT4	Programa de reactivos para el SIDA de los NIH	120	Este reactivo se obtuvo a través del Programa de Reactivos para el SIDA de los NIH, División de SIDA, NIAID, NIH: MT-4 del Dr. Douglas Richman.
Células reporteras HEK-Blu IFN-α/β	Invivogen	HKB-IFNAB
RPMI	bisonte europeo	350-000-CL
DMEM	bisonte europeo	319-005-CL
FBS	bisonte europeo	080-150
PHA-L	Sigma-Aldrich	O2769
Kit de aislamiento de células T CD4+ II	Myltenyi	130-091-155
Kit de aislamiento de células dendríticas plasmocitoide de diamante II	Myltenyi	130-097-240
QUANTI-Azul	Cedarlán	REP-QB2
2,5 mg/ml de IgG humana	Sigma-Aldrich	I 4506