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1. Medición de IFN bioactivo tipo I utilizando células reporteras HEK-Blue IFN-α/β.
>Nota: Estas células se generaron mediante la transfección estable de células HEK293 con los genes humanos STAT2 e IRF9 para obtener una vía de señalización de IFN tipo I completamente activa. También contienen el gen reportero de la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) bajo el control del promotor inducible de IFN-α/β ISG54. La estimulación de estas células con IFN tipo I activa la vía JAK/STAT/ISGF3 e induce la producción de SEAP.
- Mantenga las células HEK-Blue IFN-α/β en DMEM suplementadas con un 10% de FBS. Póngalos a una densidad de 50.000 células por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos, con un volumen final de 180 μl.
- Mezcle 220 μl de PBMC (diluidas a 850.000 células/ml) o 220 μl de células dendríticas plasmocitoides (pDC) (a una concentración comprendida entre 100.000 y 500.000 células/ml) con 30 μl de células T infectadas (diluidas a 106 células/ml) por pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo en U.
- Incubar los cocultivos a 37 °C y 5% de CO2 durante 18-22 horas, y luego transferirlos a una placa de 96 pocillos con fondo en V. Centrífuga durante 5 min a 400 x g.
- Añadir 20 μl de sobrenadante de cocultivo a cada pocillo por duplicado. Cada placa también requiere un conjunto de controles estándar internos (IFNα humano, concentración final de 100 U/ml a 2.500 U/ml). Incubar las placas a 37 °C y 5% de CO2 durante 18-22 h.
- Determine los niveles de actividad de la fosfatasa alcalina utilizando la solución QUANTI-Blue, que cambia de rosa a púrpura/azul en presencia de la enzima. Prepare QUANTI-Blue siguiendo las recomendaciones del fabricante. Agregue 180 μl de esta solución a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. A cada pocillo se añaden también 20 μl de los sobrenadantes inducidos de las células HEK-Blue IFN-α/β e incubar la placa en una incubadora a 37 °C hasta que se desarrolle el color en los pocillos de control estándar de IFN.
- Evalúe los niveles de SEAP utilizando un espectrofotómetro a 620-655 nm y determine la concentración de IFN tipo I por extrapolación de la parte lineal de la curva estándar de IFN.