Una técnica para la generación de partículas similares al virus de la gripe a través de un sistema de mamíferos

Resumen

Fuente: Arévalo, M. T., et al.Expresión y purificación de partículas similares a virus para la vacunación. J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra la generación de partículas similares al virus de la influenza (VLP) en un sistema de mamíferos. Al expresar tres vectores de expresión eucariotas, que codifican diferentes proteínas estructurales virales, en células huésped de mamíferos adecuadas, las proteínas virales expresadas se autoensamblan en VLP en la membrana plasmática del huésped y se liberan a través de la gemación desde la superficie celular.

Protocolo

1. Sistema de expresión de mamíferos para la generación de VLP de influenza H3N2

1. Subclonar las glicoproteínas estructurales virales hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) Gag (antígeno específico del grupo) p55 en vectores de expresión eucariotas, como pTR600 descrito anteriormente.
2. Amplifique el ADN en Escherichia coli químicamente competente (por ejemplo, DH5α) y aísle el plásmido de grado de transfección utilizando un kit de purificación de plásmidos según las instrucciones del fabricante. La cantidad de ADN depende del rendimiento y de las necesidades del usuario.
3. Mantener la línea celular de mamíferos, 293T, en un medio de crecimiento que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) a 37 °C con 5% de CO₂ en una incubadora humidificada.
4. Cultive las células de manera que un matraz de cultivo de tejidos T-150 contenga 45-75 x 10⁶ células por matraz, de modo que el matraz obtenga una adherencia celular completa y un 85-95% de confluencia celular al día siguiente. Inspeccione las células bajo el microscopio para ver si tienen la confluencia deseada.
   nota: Por lo general, se recomienda una alta densidad celular para producir una expresión proteica óptima con una citotoxicidad mínima cuando se utilizan reactivos de transfección comerciales, sin embargo, la confluencia excesiva puede resultar en la acumulación de subproductos de desechos celulares y reducir la viabilidad celular.
5. El día de la transfección, prepare la mezcla de liposomas y ADN según las recomendaciones del fabricante y transfecte células de ADN con una composición de ADN de 1:1:2 de HA:NA:Gag con una cantidad total de ADN de 40 μg por matraz T-150. Diluir las soluciones de ADN y liposomas en medios de transfección sin suero sin antibióticos, de modo que cada matraz contenga un volumen total de 20-30 ml.
   nota: La proporción de construcciones genéticas puede requerir la optimización del usuario. Aunque no se ha demostrado aquí, se ha realizado un procedimiento de transfección similar con el virus respiratorio sincitial (VRS) F y la mordaza del VIH en una proporción de 1:1. Para los plásmidos de expresión simple DENV y CHIKV, se utiliza un total de 20 μg de ADN por matraz T-150 para una expresión óptima. Las proporciones de reactivos de ADN:transfección están optimizadas por el usuario. Utilice el medio de transfección recomendado según el método de transfección, es decir, las transfecciones de lípidos policatiónicos recomiendan la reducción o ausencia de suero fetal bovino, por lo que los medios pueden complementarse con hormonas de crecimiento y oligoelementos para apoyar el crecimiento en ausencia de suero.
6. Retornar los matraces a 37 °C con incubadora de 5% de CO₂. Para un volumen de 200 ml, utilizar 9 matraces T-150. Las células se mantienen en un medio de cultivo de transfección hasta el día de la recolección de VLP.
7. Recolectar el sobrenadante del cultivo de las células después de 72-96 horas después de la transfección, dependiendo del antígeno, o cuando la viabilidad celular ha disminuido al 70-80%, según lo estimado por inspección microscópica. Transfiera el sobrenadante a tubos cónicos de 50 ml y centrije las células a 500 × g durante 5 min a 4 °C para pellizar los restos celulares.
   Nota: La sustitución del sobrenadante de 3 días por medios de transfección frescos precalentados y sin suero por las células adherentes producirá un segundo lote de VLP con un rendimiento similar o ligeramente reducido y debe ser optimizado por el usuario.
8. Piscina sobrenadante y filtrado a través de una membrana de poro de 0,22 μm antes de la sedimentación mediante ultracentrifugación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Maxi kit de plásmido	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamina	Tecnologías de la Vida	L3000075	Lipofectamina 2000, Lipofectamina 3000
Opti-MEM I	Tecnologías de la Vida	31985062
Placa agitadora multipunto Cimarec I 6	ThermoFisher Scientific	50094596
Tubos ultracentrífugos Polyclear	Seton	7025
Tapa del filtro de vacío de 0,22 μm (500 ml)	Nalgene	569-0020
glicerol	sigma	G5516