Generación de partículas similares al virus chikungunya utilizando el sistema de expresión de baculovirus en células de insectos

Resumen

Fuente: Arévalo, M. T. et al., Expresión y purificación de partículas similares a virus para la vacunación.J. Vis. Exp. (2016)

Este video muestra cómo se generan partículas similares a virus, VLP, infectando células de insectos con un baculovirus recombinante portador del casete del gen del virus chikungunya. El virus recombinante infecta las células, lo que provoca la formación, el ensamblaje y la liberación de VLP en el medio de cultivo para su posible uso en la producción de vacunas.

Protocolo

>1. Expresión de partículas similares al virus chikungunya (VLP) utilizando un sistema de células de baculovirus/insectos

1. Generar baculovirus recombinantes que expresan la cápside y las proteínas de la envoltura del virus chikungunya (C-E3-E2-6K-E1) de la cepa S-27 utilizando un sistema comercial de expresión de baculovirus.
2. Cultivo de células de Spodoptera frugiperda Sf9 en medio de crecimiento Sf9 sin suero con 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina a 28 °C. Utilizar 3-5 x 10⁵ c/ml para iniciar cultivos de matraces giratorios para el crecimiento de células en suspensión. De paso rutinario cuando alcanzan densidades celulares de 2-4 x 10⁶ c/ml (cada 3-4 días).
3. Cultivo de células Sf9 en suspensión en matraces giratorios con agitación a 130 rpm en un sistema de placas agitadoras multipunto. Para una aireación adecuada, mantenga los volúmenes de cultivo a no más de la mitad del volumen del matraz giratorio.
4. Para la expresión de VLPs de Chikungunya o CHIK, infectar las células Sf9 a una densidad de 2 x 10⁶ células/ml con baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección de 1 y devolver a la incubadora a 28 °C. Normalmente, infecta uno o dos matraces giratorios, que contienen 250 ml de células Sf9.
   nota: Aunque no utilizamos este método, las células Sf9 pueden cultivarse en matraces agitadores a 28 °C utilizando una plataforma agitadora.
5. Coseche los cultivos después de 72-96 horas después de la infección, o cuando la viabilidad celular haya disminuido al 70-80% según lo determinado por la exclusión de azul de tripano de acuerdo con el protocolo del fabricante><. nota: Las células continúan proliferando mientras están infectadas y hay una viabilidad de ~ 80% en cultivos Sf9 infectados con baculovirus CHIK VLP recombinante a los 3 días posteriores a la infección (dpi). Las células infectadas por baculovirus son más grandes en apariencia. La morfología también puede cambiar de redonda a oblonga. En las últimas etapas de las infecciones por baculovirus, las células comenzaron a lisarse.
6. Transfiera los cultivos directamente del cultivo en suspensión a tubos cónicos de 50 ml y centrifuga las células a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
7. Recoja los sobrenadantes y filtre a través de una membrana de poros de 0,22 μm antes de la sedimentación mediante ultracentrifugación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Opti-MEM I	Tecnologías de la Vida	31985062
Sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac	Tecnologías de la Vida	10359-016
Tapa del filtro de vacío de 0,22 μm (500 ml)	Nalgene	569-0020
SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	10902-096
Placa agitadora multipunto Cimarec I 6	ThermoFisher Scientific	50094596