Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Manejo de animales, preparación e inducción de inflamación
- Utilice ratones machos de 4 a 6 semanas de edad con un rango de peso de 16 a 20 g. Nota: Si los ratones son mayores o más pesados, presentan un exceso de grasa alrededor del vaso, lo que limita la observación microscópica.
- Esterilice todas las herramientas y la mesa del microscopio antes de la cirugía.
- Inyectar 20 mg/kg de LPS (lipopolisacárido) por vía intraperitoneal 4 horas antes de la microscopía en el ratón vivo para inducir una inflamación bacteriana.
- Precalentar una solución salina al 0,9% en un baño de agua a 37 °C para humidificar la cámara de plástico y el tejido mesenterio.
- Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg) justo antes del procedimiento de microscopía. Se puede utilizar anestesia alternativa, por ejemplo, inhalación de isoflurano al 2%. Confirmar la correcta anestesia mediante la pérdida de respuesta a la estimulación refleja (pellizco de la punta del pie o de la cola con presión firme).
- Depila el abdomen con una afeitadora y retira el vello suelto con una gasa saturada con etanol al 70%.
- Aplique ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar la sequedad, mientras está bajo anestesia.
>2. Cirugía
- Esterilizar el abdomen con etanol al 70%. Este método no es estéril y podría ser letal al final del experimento.
- Realizar una laparotomía mediana: Abra la piel abdominal con pinzas pequeñas y curvas y tijeras pequeñas. Identificar los vasos epigástricos y abrir el peritoneo en la región de la línea alba, para proteger los vasos.
- Aplique unas gotas de solución salina precalentada en la cavidad abdominal para mantener el tejido húmedo.
- Marcaje los leucocitos y las plaquetas con fluorescencia inyectando 50 μl de rodamina 6G (1 mg/ml) por vía retroorbital.
- Exteriorizar un asa de íleon y colocarlo en una placa de Petri de 10 cm de diámetro; asegúrese de mantener el tejido húmedo aplicando la solución salina precalentada a 37 °C (0,9%) cada dos minutos.
>3. Microscopía intravital
- Coloque el ratón debajo del microscopio y coloque la vena del mesenterio con un diámetro de 200 a 300 μm en el centro de la vista. Elija un recipiente sin grasa visible.
- No tocar los vasos del mesenterio, evitando así la estimulación del endotelio. Manipule el asa del íleon con cuidado.
- Visualice las interacciones endoteliales de las células sanguíneas con un microscopio invertido o vertical y una cámara mediante el software de microscopio. Registre las interacciones entre las células sanguíneas y el endotelio durante 1 minuto en 4 venas diferentes por ratón.
- Sacrificar al ratón por dislocación cervical después de la finalización de los experimentos de imagen.
4. Análisis
- Realice el análisis fuera de línea y a ciegas para todos los parámetros. Realizar análisis utilizando cualquier programa de software adecuado.
- Confirme las condiciones de flujo sanguíneo estables e interindividuales comparables en clips de cine de alta resolución de tiempo (velocidad de fotogramas máxima) centrados en el flujo de células sanguíneas intraluminales.
- Cuantificar el número de leucocitos rodantes. Por lo tanto, dibuje una línea vertical a través de la vena y cuente todos los leucocitos que cruzan esta línea en 1 minuto.
- Determine la velocidad de rodadura midiendo el tiempo que un solo leucocito necesita para pasar una distancia de 50 μm mientras rueda de manera estable sobre el endotelio. Para hacer esto, dibuje dos líneas verticales a una distancia de 50 μm a través de la vena.
- Mide el tiempo que un leucocto representativo necesita para pasar de una línea a la otra. Calcule la velocidad de los leucocitos dividiendo 50 μm entre el tiempo necesario (μm/s).
- Mida la adhesión de los leucocitos en un campo de 0,04 mm2. Para hacer esto, dibuje un cuadrado con una longitud de lado de 200 μm en la vena.
- Cuente los leucocitos adherentes firmes, definidos como sin movimiento visible durante 30 segundos, dentro de este cuadrado.
- Cuente el número de plaquetas unidas a un leucocitos para cuantificar las interacciones entre plaquetas y leucocitos.
