Inyección subcutánea de antígeno bacteriano para inducir inflamación sistémica en un modelo murino

Resumen

Fuente: John, S. et al., Uveítis micobacteriana cebada (PMU) como modelo para la uveítis postinfecciosa.J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra la inducción de inflamación sistémica en un ratón anestesiado. La inyección de depósitos de adyuvantes de antígenos micobacterianos desencadena la liberación de citocinas y la inflamación localizada. Los vasos linfáticos se abren, lo que permite la entrada de las células inmunitarias en los ganglios linfáticos y la activación de las células T, que liberan citocinas proinflamatorias, lo que provoca una inflamación generalizada.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Preparación de antígenos para inyección subcutánea

1. Realice todos los procedimientos de esta sección dentro de una campana extractora química para evitar la inhalación o el contacto de la piel con el polvo Mycobacterium tuberculosis, Mtb H37Ra. Manéjelo de acuerdo con sus políticas institucionales para el adyuvante de Freund completo (generalmente BSL-1). Esto incluye el uso de guantes resistentes a los productos químicos, gafas de seguridad y ropa de trabajo protectora (bata de laboratorio).
2. Utilizar una buena técnica estéril para evitar la contaminación de los reactivos que se introducirán en los animales de experimentación.
3. Prepare la suspensión de Mtb en solución salina tamponada con fosfato (PBS) mezclando 5 mg de polvo liofilizado de Mycobacterium tuberculosis H37Ra con 2,5 mL de PBS frío en un tubo de microcentrífuga de 5 mL. Vértice una vez durante 30 segundos y luego colóquelo en hielo.
4. Para generar una suspensión fina del H37Ra en PBS, sonique la suspensión en hielo durante 5 minutos.
   1. Suelte el cuerpo de la unidad convertidora y limpie la sonda con un hisopo con alcohol al 70% (v/v).
   2. Encienda el sonicador, ajuste la configuración de potencia a 4 girando la perilla de control de potencia y sumerja la punta de la sonda en el polvo micobacteriano que contiene PBS. Asegúrese de que la punta de la sonda esté sumergida al menos a la mitad de la profundidad de la muestra y de que la punta de la sonda no toque la pared del tubo de microcentrífuga.
5. Sonicar la mezcla en hielo durante 30 segundos, hacer una pausa de 30 segundos y repetir durante un total de 5 minutos para dispersar completamente el polvo en una suspensión uniforme sin calentar el líquido.
6. Añade 2,5 ml de adyuvante incompleto de Freund a la mezcla y repite el proceso de sonicación con hielo hasta que la emulsión adquiera una consistencia similar a la de una pasta de dientes.
7. Ajuste la potencia a 0 con el mando de control y apague la unidad para finalizar la sonicación. Retire la punta de la suspensión y limpie la sonda con un hisopo con alcohol.
8. Almacene la emulsión de antígenos a 4 °C. Hacer lotes de la emulsión ayudará a garantizar la consistencia en todos los experimentos. La emulsión puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 3 meses.

>2. Inyección subcutánea

1. Realice la inyección subcutánea una semana antes de la inyección intravítrea (designada como día -7).
2. Cargue una jeringa de 1 mL (sin aguja) con la emulsión micobacteriana. Debido a la viscosidad y opacidad de la emulsión, las burbujas de aire difíciles de ver pueden llenar la jeringa.
   1. Para evitar burbujas de aire en la jeringa, después de cargar 0,2-0,3 ml de emulsión, invierta la jeringa (con la punta hacia arriba) y golpee suavemente la jeringa repetidamente en el borde de un mostrador para llevar las burbujas a la superficie.
3. Expulse el aire de la jeringa y continúe llenando la jeringa. Invierta y golpee intermitentemente hasta que se llene.
4. Coloque una aguja de 25 G en la jeringa y avance la emulsión para llenar la aguja. Guarde la jeringa en hielo hasta que la use.
5. Para realizar la inyección subcutánea de manera segura, anestesia al ratón o utilice métodos de restricción humanitarios que permitan un fácil acceso a los cuartos traseros del animal.
6. Para anestesiar la inyección subcutánea, colocar al animal en una cámara de inducción de isoflurano (3%-4% para inducción y 1%-3% para mantenimiento). Una vez anestesiado, asegúrese de que el ratón tenga una frecuencia respiratoria lenta y no muestre signos de dificultad respiratoria.
7. Coloque las inyecciones subcutáneas en la superficie dorsal de las caderas o en la superficie ventral de las piernas proximales a la región de los ganglios linfáticos inguinales.
   1. Inserte con cuidado la aguja para evitar que se inyecte en el músculo. Inyecte 0,05 mL de la emulsión de Mtb en el espacio subcutáneo. No retire la aguja inmediatamente para permitir que la emulsión espesa se inyecte por completo.
   2. Repita la inyección tanto en el lado izquierdo como en el derecho hasta obtener un total de 0,1 ml por animal.
8. Si está anestesiado, coloque el mouse sobre una almohadilla térmica tibia hasta que se recupere por completo. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
9. Regrese el ratón a su jaula una vez que se haya recuperado por completo y etiquete la tarjeta de la jaula con la fecha de la inyección subcutánea.
10. Proporcionar analgesia con paracetamol oral (200 mg/kg/día), pero no con antiinflamatorios no esteroideos (AINE), ya que los agentes antiinflamatorios pueden influir en la inducción de uveítis.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Adyuvante incompleto de Freund	BD Difco, Nueva Jersey, Estados Unidos	263910
Extracto de micobacterias liofilizadas H37Ra	BD Difco, Nueva Jersey, Estados Unidos	231141
Aguja de insulina	Exel International, Estados Unidos	26029	1 mL
Isoflurano
Pbs	Gibco	Año 14190
RM2255	Leica Biosystems, Illinois, EE. UU.		Seccionamiento de tejidos
Jeringa TB	Becton, Dickinson y Compañía, Nueva Jersey, Estados Unidos	309602	1 mL
Tylenol	Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, EE.UU.	NDC 50580-614-01	acetaminofén