Un modelo murino de uveítis micobacteriana preparada para estudiar la uveítis posinfecciosa

Resumen

Fuente: John, S., et al. Uveítis micobacteriana (PMU) preparada como modelo para la uveítis postinfecciosa. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra un método para generar un modelo de ratón de uveítis micobacteriana cebada (PMU) para estudiar la uveítis postinfecciosa. Tras la inducción de PMU por inyección intravítrea de Mycobacterium tuberculosis muerto por calor en un ratón previamente inmunizado con el mismo inmunógeno, se analiza la progresión de la inflamación crónica en el ojo mediante imágenes y examen histopatológico

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Preparación de antígenos para inyección subcutánea

1. Realice todos los procedimientos de esta sección dentro de una campana extractora química para evitar la inhalación o el contacto de la piel con el polvo H37Ra de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Manéjelo de acuerdo con sus políticas institucionales para el adyuvante de Freund completo (generalmente BSL-1). Esto incluye el uso de guantes resistentes a los productos químicos, gafas de seguridad y ropa de trabajo protectora (bata de laboratorio).
2. Utilizar una buena técnica estéril para evitar la contaminación de los reactivos que se introducirán en los animales de experimentación.
3. Prepare la suspensión de Mtb en solución salina tamponada con fosfato (PBS) mezclando 5 mg de polvo Mtb H37Ra liofilizado y matado por calor con 2,5 mL de PBS frío en un tubo de microcentrífuga de 5 mL. Vértice una vez durante 30 segundos y luego colóquelo en hielo.
4. Para generar una suspensión fina del H37Ra en PBS, sonique la suspensión en hielo durante 5 minutos.
   1. Suelte el cuerpo de la unidad convertidora y limpie la sonda con un hisopo con alcohol al 70% (v/v).
   2. Encienda el sonicador, ajuste la configuración de potencia a 4 girando la perilla de control de potencia y sumerja la punta de la sonda en el polvo micobacteriano que contiene PBS. Asegúrese de que la punta de la sonda esté sumergida al menos a la mitad de la profundidad de la muestra y de que la punta de la sonda no toque la pared del tubo de microcentrífuga.
5. Sonicar la mezcla en hielo durante 30 segundos, hacer una pausa de 30 segundos y repetir durante un total de 5 minutos para dispersar completamente el polvo en una suspensión uniforme sin calentar el líquido.
6. Añade 2,5 ml de adyuvante incompleto de Freund a la mezcla y repite el proceso de sonicación con hielo hasta que la emulsión adquiera una consistencia similar a la de una pasta de dientes.
7. Ajuste la potencia a 0 con el mando de control y apague la unidad para finalizar la sonicación. Retire la punta de la suspensión y limpie la sonda con un hisopo con alcohol.
8. Almacene la emulsión de antígenos a 4 °C. Hacer lotes de la emulsión ayudará a garantizar la consistencia en todos los experimentos. La emulsión puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 3 meses.

>2. Inyección subcutánea

1. Realice la inyección subcutánea una semana antes de la inyección intravítrea (IVT) (designada como día -7).
2. Cargue una jeringa de 1 mL (sin aguja) con la emulsión micobacteriana. Debido a la viscosidad y opacidad de la emulsión, las burbujas de aire difíciles de ver pueden llenar la jeringa.
   1. Para evitar burbujas de aire en la jeringa, después de cargar 0,2-0,3 ml de emulsión, invierta la jeringa (con la punta hacia arriba) y golpee suavemente la jeringa repetidamente en el borde de un mostrador para llevar las burbujas a la superficie.
3. Expulse el aire de la jeringa y continúe llenando la jeringa. Invierta y golpee intermitentemente hasta que se llene.
4. Coloque una aguja de 25 G en la jeringa y avance la emulsión para llenar la aguja. Guarde la jeringa en hielo hasta que la use.
5. Para realizar la inyección subcutánea de manera segura, anestesia al ratón o utilice métodos de restricción humanitarios que permitan un fácil acceso a los cuartos traseros del animal.
6. Para anestesiar la inyección subcutánea, colocar al animal en una cámara de inducción de isoflurano (3%-4% para inducción y 1%-3% para mantenimiento). Una vez anestesiado, asegúrese de que el ratón tenga una frecuencia respiratoria lenta y no muestre signos de dificultad respiratoria.
7. Coloque las inyecciones subcutáneas en la superficie dorsal de las caderas o en la superficie ventral de las piernas proximales a la región de los ganglios linfáticos inguinales.
   1. Inserte con cuidado la aguja para evitar que se inyecte en el músculo. Inyecte 0,05 mL de la emulsión de Mtb en el espacio subcutáneo. No retire la aguja inmediatamente para permitir que la emulsión espesa se inyecte por completo.
   2. Repita la inyección tanto en el lado izquierdo como en el derecho hasta obtener un total de 0,1 ml por animal.
8. Si está anestesiado, coloque el mouse sobre una almohadilla térmica tibia hasta que se recupere por completo. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
9. Regrese el ratón a su jaula una vez que se haya recuperado por completo y etiquete la tarjeta de la jaula con la fecha de la inyección subcutánea.
10. Proporcionar analgesia con paracetamol oral (200 mg/kg/día), pero no antiinflamatorios no esteroideos (AINE), ya que los agentes antiinflamatorios pueden influir en la inducción de uveítis.

>3. Preparación de stock de antígeno para inyección intravítrea

1. Realice todos los procedimientos de esta sección en condiciones estériles adecuadas para evitar la contaminación de la suspensión intravítrea de Mtb.
2. Realizar las suspensiones intravítreas.
   1. Para la inducción de panuveítis leve a moderada, prepare la suspensión intravítrea a una concentración de 5 mg/mL añadiendo 5 mg del extracto de micobacterias a 1 mL de 1x PBS.
   2. Para la inducción de panuveítis moderada a grave, prepare la suspensión intravítrea a una concentración de 10 mg/mL añadiendo 10 mg del extracto de micobacterias a 1 mL de 1x PBS.
3. Vértice una vez durante 30 segundos y luego colóquelo en hielo.
4. Para generar una suspensión fina del H37Ra en PBS, sonique la suspensión en hielo durante 10 minutos como se describe en el paso 1.4. Alicuone esta solución madre en volúmenes de 100 μL y almacene a -20 °C.
5. Antes de usar, descongele a temperatura ambiente y en vórtice a temperatura alta durante 1 min. Mantenga las alícuotas en hielo mientras las transporta a la instalación de animales.

>4. Procedimiento de inyección intravítrea en el día 0

1. Preparación animal
   1. Use guantes de examen ajustados y coloque el ratón en una balanza de pesaje para obtener su peso en gramos.
   2. Administrar una inyección intraperitoneal de 0,02 mL/g de peso corporal de una solución que contenga 100 mg/mL de ketamina y 20 mg/mL de xilacina mezclados con agua estéril para anestesiar al animal. Un enfoque alternativo incluye la inducción con ~1,5% de isoflurano (inhalado).
   3. Espere aproximadamente 2 minutos para que el mouse se duerma y luego coloque el mouse en una caja térmica y cubra la tapa. Realice pruebas de reflejos del dolor, como el pinzamiento de la oreja, el dedo del pie y la cola para evaluar la profundidad de la anestesia para el procedimiento.
   4. Una vez dormido, anestesiar la córnea con 1 gota de tetracaína al 0,5% (v/v). Evite que la tetracaína se acerque a la nariz o la boca del ratón. Después de 10 s, elimine el exceso de líquido.
      nota: Se ha observado que la dilatación del iris y la visualización de la cámara anterior (CA) mejoran cuando se administra anestesia tópica, posiblemente debido a la mejora de la supresión del reflejo corneal con la anestesia sistémica y tópica combinada. Sin embargo, este paso puede omitirse si se desea.
   5. Dilatar la pupila con 1 gota de fenilefrina al 2,5% (v/v). Tenga cuidado para evitar cualquier exceso de gotas que puedan entrar en la nariz o la boca. Después de 2-3 minutos, elimine el exceso de líquido.
   6. Para disminuir el riesgo de endoftalmitis, agregue 1 gota de betadine al 5% en la superficie de los ojos y el cabello circundante. Dejar actuar durante 2-3 min.
      nota: Realizar todos los procedimientos de esta sección en condiciones estériles apropiadas para prevenir la endoftalmitis.
   7. Retirar betadine y cubrir el ojo con hipromelosa (0,3%) o gel ocular de carbómero (0,2% p/p) para evitar la sequedad bajo anestesia. Esto también ayudará a prevenir la formación de cataratas.
2. Configuración del sistema de microinyección
   1. Realice la inyección intravítrea utilizando una microbomba conectada a un controlador de bomba de microjeringa y una jeringa de inyección (Figura 1A-C). Alternativamente, inyecte con una aguja de 33 G conectada a una jeringa Hamilton como se describe en la subsección 4.4.
   2. Conecte una aguja de 34 G al soporte de inyección para ensamblar el inyector. Afloje el tapón de rosca plateado en el extremo delantero del soporte de inyección y deslice la aguja en el cuerpo del soporte aproximadamente hasta la mitad. Apriete el tapón de rosca plateado con los dedos.
   3. Conecte el tubo al soporte de inyección como se menciona en los pasos 4.2.4-4.2.5.
   4. Para insertar el tubo en el soporte de inyección, afloje el tornillo de plástico en el extremo posterior del soporte, deslice el tubo a través de la junta en el interior y apriete el tornillo.
   5. Mantenga un ligero espacio con el extremo del tubo para evitar daños durante la inyección. Consulte la Figura 1C.
   6. Descongele una alícuota de 100 μL de la suspensión de stock de micobacterias.
   7. Agregue 3 μL de una solución de fluoresceína sódica al 1% (AK-Fluor) y pocillo de vórtice.
   8. Cargue una jeringa de 10 μL con la mezcla de antígeno y fluoresceína sin incluir burbujas de aire.
   9. Retire la aguja de carga de la jeringa y deslice el tubo a través de la junta del tapón de rosca plateado hasta que la punta alcance la marca cero en el cuerpo de la jeringa.
   10. Una vez que la punta del tubo esté correctamente alineada con la posición deseada, apriete el tapón de rosca con los dedos.
   11. Enjuague la solución en la jeringa a través del tubo de inyección para cargar completamente el sistema. A continuación, repita los pasos 4.2.8-4.2.11 para volver a cargar la jeringa para la inyección.
   12. Para instalar la jeringa cargada en la microbomba, presione el botón de liberación de la abrazadera en el extremo de la microbomba para abrir las pinzas de la jeringa.
   13. Coloque la tapa del émbolo en el soporte de la tapa del émbolo en el extremo trasero de la microbomba.
   14. A continuación, deslice el collar de la jeringa en el tope del collar y el cuerpo de la jeringa en la pinza de la jeringa.
   15. Suelte el botón de la abrazadera y apriete el tornillo de retención del émbolo. Consulte la Figura 1D.
   16. Deslice el soporte de inyección y la aguja a través de la pinza tórica del aparato de inyección estereotáctica. Esta es una plataforma personalizada; Alternativamente, la jeringa se puede sostener y colocar manualmente.
   17. Ajuste el volumen de infusión y la tasa de volumen de infusión en el controlador de la bomba de microjeringa para inyectar 500 nL por ciclo a una velocidad de 40 nL/s, respectivamente.
       nota: Se pueden usar velocidades de inyección más rápidas, sin embargo, se puede experimentar más reflujo antes de que se pueda lograr el reposicionamiento de la aguja.
   18. Pruebe el sistema para garantizar el correcto funcionamiento antes de realizar una inyección intravítrea.
       nota: Cuando el sistema de inyección funciona correctamente, la activación de un ciclo de inyección con el pedal o el panel de control producirá un movimiento visible del soporte de la tapa del émbolo y se verá una pequeña gota de líquido verdoso en la punta de la aguja. En el caso de que no se produzca líquido, active ciclos adicionales o enjuague y recargue la jeringa.
   19. Antes de inyectar el ojo, limpie suavemente la aguja con una almohadilla de etanol al 95%.
3. Procedimiento de inyección intravítrea
   1. El ratón se coloca en un aparato estereotáxico para realizar el procedimiento de inyección.
   2. Mantenga caliente el escenario/plataforma en el que descansa el ratón colocando 2-3 toallas de papel en su superficie.
   3. Coloque el ratón en posición prona sobre la plataforma. Use las barras de la oreja derecha e izquierda para fijar suavemente la cabeza del animal. Consulte la Figura 1E.
   4. Coloque el ratón y oriéntelo debajo del visor de modo que se vea la cara nasal superior del ojo derecho.
   5. Utilice una aguja de 30 g para desplazar las pestañas y exponer la esclerótica. Visualiza el limbo y el vaso sanguíneo radial.
   6. Utilice una aguja estéril de 30 g para hacer un orificio guía en la esclerótica de 1-2 mm posterior al limbo.
   7. Inserte la aguja de 34 G conectada al soporte de inyección en el ojo a través del orificio guía en un ángulo que evite la lente, pero coloque la punta de la aguja en la cavidad vítrea.
   8. Con el controlador de la bomba de microjeringa, inyecte con cuidado 1 μL del extracto de Mtb en la cavidad vítrea. En caso de reflujo constante, aumentar el volumen de inyección a 1,5 μL para asegurar una administración adecuada de la dosis.
      nota: En el caso de los controles simulados, inyecte 1 μL de PBS en el ojo del animal.
   9. Verifica la colocación intravítrea mediante la visualización de un reflejo verdoso en el ojo. Consulte la Figura 1F.
   10. Después de 10 segundos, retire la aguja del ojo. Fíjate en cualquier reflujo.
   11. Retire el ratón de la plataforma, coloque un ungüento ocular de carbómero al 0,3 % de hipromelosa o al 0,2 % p/w en ambos ojos para proteger la córnea y muévalo a la caja de calentamiento de recuperación.
   12. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. No regrese a la compañía de otros animales hasta que estén completamente recuperados.
   13. Cuando el ratón esté completamente despierto, regrese a la jaula y agregue una botella de agua medicinal con acetaminofén (200-300 mg / kg / día). Etiquete la tarjeta de la jaula con la fecha de la inyección de IVT.
   14. Las inyecciones intravítreas son generalmente bien toleradas. Los signos clínicos que pueden indicar dolor y la necesidad de retirarse del estudio incluyen alopecia periocular (indicativa de autotraumatismo), ulceración de la córnea, pérdida de peso y postura encorvada.

Resultados

Figura 1: Configuración de la inyección intravítrea en ratón. La inyección intravítrea se realiza en el ojo del ratón utilizando (A) un controlador de bomba de microjeringa conectado a la (B) microbomba y (C) una jeringa de inyección. La jeringa se carga y se monta en la microbomba (D). La cabeza del ratón se coloca utilizando barras...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AK-FLUOR	Akorn Pharmaceuticals, Illinois, Estados Unidos		10% Fluoresceína sódica 100 mg/mL en vial de 5 mL
AnaSed	Akorn Animal Health, Illinois, EE. UU.	NDC 59399-110-20	Xilacina 20 mg/mL
Betadine 5% Solución de Preparación Oftálmica Estéril	Alcon, TX, Estados Unidos	8007-1
Agujas de deslizamiento de precisión B-D -25 g	Becton, Dickinson y Compañía, Nueva Jersey, Estados Unidos	305122
Aguja B-D Precision Glide -30-G	Becton, Dickinson y Compañía, Nueva Jersey, Estados Unidos	305106
Bond MAX, Bond Rx	Leica Biosystems, Illinois, EE. UU.		Sistema automatizado de tinción IHQ
Pomada de cloranfenicol	Martindale Pharma, Romford, Reino Unido		1% p/p de cloranfenicol
EG1150H	Leica Biosystems, Illinois, EE. UU.		Inclusión de tejidos
Envisu R2300	Bioptigen/Leica		Máquina OCT
Adyuvante incompleto de Freund	BD Difco, Nueva Jersey, Estados Unidos	263910
Ungüento ocular lubricante GenTeal	Alcon, TX, Estados Unidos	---
Gel lubricante para ojos GenTeal	Alcon, TX, Estados Unidos	---
Extracto de micobacterias liofilizadas H37Ra	BD Difco, Nueva Jersey, Estados Unidos	231141
Aguja Hamilton RN (33/12/2)S	Hamilton, Reno, NV	7803-05(33/12/2)	33 G
Jeringa Hamilton	Hamilton, Reno, NV	CAL7633-01	5 μL
Aguja de insulina	Exel International, Estados Unidos	26029	1 mL
Isoflurano
Ketaset	Zoetis, Estados Unidos	377341	Ketamina HCL 100 mg/mL
Bomba de jeringa de microinyección y Micro4Controller	Instrumentos de precisión mundial, FL, EE. UU.	UMP3
Micras IV	Laboratorios de Investigación de Phoenix, Pleasanton, CA		Máquina alternativa de imagen/OCT
Jeringa Nanofil 10 μL	Instrumentos de precisión mundial, FL, EE. UU.	NANOFIL
Kit de inyección intraocular Nanofil	Instrumentos de precisión mundial, FL, EE. UU.	IO-KIT
Olympus SZX10	Olimpo		Ámbito de disección
Pbs	Gibco	Año 14190
Clorhidrato de fenilefrina solución oftálmica USP 2.5% estéril 15 mL	Akorn Pharmaceuticals, Illinois, Estados Unidos	17478020115
RM2255	Leica Biosystems, Illinois, EE. UU.		Seccionamiento de tejidos
Jeringa TB	Becton, Dickinson y Compañía, Nueva Jersey, Estados Unidos	309602	1 mL
Tetracaína 0,5%	Alcon, TX, Estados Unidos	1041544
Serie VIP Tissue Tek	Sakura Finetek USA, Inc.,CA.		Histología Procesamiento de tejidos
Tropicamida 1%	Chauvin Pharmaceuticals, Romford, Reino Unido		Mínimos
Tylenol	Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, EE.UU.	NDC 50580-614-01	acetaminofén
Viscolágrimas	Novartis Pharmaceuticals, Camberley, Reino Unido		Gel de ojos de carbómero 0,2% p/p