Preparación y cuantificación de Mycobacterium bovis BCG lux Inóculo para la infección

Resumen

Fuente: Asai, M. et al., Uso del invertebrado Galleria mellonella como modelo de infección para estudiar el complejo Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la preparación y cuantificación del inóculo de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux utilizando el ensayo de bioluminiscencia y la enumeración de unidades formadoras de colonias. El inóculo preparado se puede utilizar para estudios de infección.

Protocolo

NOTA: Todos los trabajos que se describen a continuación deben realizarse en un laboratorio CL2 dentro de una cabina de seguridad microbiológica (MSC) de clase 2 siguiendo las directrices locales de salud y seguridad.

1. Preparación de M. bovis BCG lux para la infección

1. Descongele un stock congelado de glicerol (15%) de 1,2 mL de glicerol de M. bovis BCG lux, la cepa de la vacuna de Montreal transformada con el plásmido lanzadera pSMT1 que lleva los genes luxAB de Vibrio harveyi que codifican la enzima luciferasa.
2. Inocular 15 mL de caldo Middlebrook 7H9 que contiene 0,2% de glicerol, 10% de albúmina, dextrosa, enriquecimiento de catalasa (ADC) y 50 μg/mL de higromicina con una alícuota descongelada de 1,2 mL de BCG lux, en un matraz Erlenmeyer de 250 mL etiquetado.
3. Colocar el matraz en un recipiente de bioseguridad sellado e incubar a 37 °C en una incubadora agitadora orbital a 220 rpm durante 72 h (o hasta que el cultivo alcance la fase media de crecimiento logarítmico).
4. Compruebe el crecimiento del cultivo de BCG lux preparando diluciones 1:10 del cultivo en tubos luminómetros utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4, tampón de fosfato 0,01 M, cloruro de potasio 0,0027 M y cloruro de sodio 0,137 M) por duplicado. Vórtice, y cargue los tubos del luminómetro en el luminómetro y mida la bioluminiscencia (unidad de luz relativa [RLU]/mL) utilizando aldehído n-decilo como sustrato (1% v/v en etanol absoluto).
   nota: La proporción de RLU/unidades formadoras de colonias (UFC) se determinó previamente en 3:1 cuando BCG lux se cultivó in vitro en caldo Middlebrook 7H9.
5. Centrifugar el cultivo a 2.175 x g durante 10 min a temperatura ambiente para granular las células y desechar el sobrenadante en un desinfectante adecuado con actividad micobactericida conocida. Deseche todos los residuos de cultivo con desinfectantes apropiados para micobacterias siguiendo las pautas locales.
6. Lave el pellet de celda dos veces en PBS que contiene 0.05% de polisorbato 80 (PBS-T) para evitar la formación de grumos bacterianos.
7. Después del lavado final, decantar el sobrenadante de desechos, volver a suspender el pellet de células micobacterianas en PBS-T y diluir la suspensión de micobacterias hasta la densidad celular deseada utilizando mediciones de RLU.
8. Prepare diluciones seriadas diez veces del inóculo en placas de 24 pocillos utilizando PBS-T. Coloque 10 μL en placas de agar Middlebrook 7H11 (0,5% de glicerol, 50 μg/mL de higromicina, 10% de ácido oleico, albúmina, dextrosa, catalasa [OADC]) por duplicado para enumerar los recuentos de UFC de inóculo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de reacción de 1,5 ml (Eppendorf)	Eppendorf	22431021
Pipeta de 20, 200 y 1000 μl y puntas filtradas	Cualquier proveedor	N/A
Placa de cultivo de 24 pocillos	Greiner	662160
Pipetas de 25 ml y Pipette Boy	Cualquier proveedor	N/A
Placa de Petri de 3 compartimentos (94/15 mm)	Greiner	637102
centrífuga	Cualquier proveedor	N/A
Gabinete de seguridad de clase II	Cualquier proveedor	N/A
Etanol (>99,7%)	VWR	208221.321
glicerol	Sigma-Aldrich	G5150
Higromicina B	Corning	30-240CR
Luminómetro (Autolumat LB 953)	Berthold	34622
Tubos luminométricos	Corning	352054
Microcentrífuga	Cualquier proveedor	N/A
Agar Middlebrook 7H11	BD Biociencia	283810
Caldo Middlebrook 7H9	BD Biociencia	271310
Enriquecimiento de Middlebrook ADC	BD Biociencia	212352
Enriquecimiento de OADC de Middlebrook	BD Biociencia	212240
Mycobacterium bovis BCG lux	varios	N/A
Aldehído N-decilo	Sigma-Aldrich	D7384-100G
Incubadora de agitación orbital	Cualquier proveedor	N/A
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Polisorbato 80 (Tween-80)	Sigma-Aldrich	P8074-500ml
Matraz Erlenmeyer con tapón ventilado (250 ml)	Corning	CLS40183
Winterm (V1.08)	Berthold	N/A	Programa LB953.TTB