NOTA: Todos los trabajos que se describen a continuación deben realizarse en un laboratorio CL2 dentro de una cabina de seguridad microbiológica (MSC) de clase 2 siguiendo las directrices locales de salud y seguridad.
1. Preparación de M. bovis BCG lux para la infección
- Descongele un stock congelado de glicerol (15%) de 1,2 mL de glicerol de M. bovis BCG lux, la cepa de la vacuna de Montreal transformada con el plásmido lanzadera pSMT1 que lleva los genes luxAB de Vibrio harveyi que codifican la enzima luciferasa.
- Inocular 15 mL de caldo Middlebrook 7H9 que contiene 0,2% de glicerol, 10% de albúmina, dextrosa, enriquecimiento de catalasa (ADC) y 50 μg/mL de higromicina con una alícuota descongelada de 1,2 mL de BCG lux, en un matraz Erlenmeyer de 250 mL etiquetado.
- Colocar el matraz en un recipiente de bioseguridad sellado e incubar a 37 °C en una incubadora agitadora orbital a 220 rpm durante 72 h (o hasta que el cultivo alcance la fase media de crecimiento logarítmico).
- Compruebe el crecimiento del cultivo de BCG lux preparando diluciones 1:10 del cultivo en tubos luminómetros utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4, tampón de fosfato 0,01 M, cloruro de potasio 0,0027 M y cloruro de sodio 0,137 M) por duplicado. Vórtice, y cargue los tubos del luminómetro en el luminómetro y mida la bioluminiscencia (unidad de luz relativa [RLU]/mL) utilizando aldehído n-decilo como sustrato (1% v/v en etanol absoluto).
nota: La proporción de RLU/unidades formadoras de colonias (UFC) se determinó previamente en 3:1 cuando BCG lux se cultivó in vitro en caldo Middlebrook 7H9.
- Centrifugar el cultivo a 2.175 x g durante 10 min a temperatura ambiente para granular las células y desechar el sobrenadante en un desinfectante adecuado con actividad micobactericida conocida. Deseche todos los residuos de cultivo con desinfectantes apropiados para micobacterias siguiendo las pautas locales.
- Lave el pellet de celda dos veces en PBS que contiene 0.05% de polisorbato 80 (PBS-T) para evitar la formación de grumos bacterianos.
- Después del lavado final, decantar el sobrenadante de desechos, volver a suspender el pellet de células micobacterianas en PBS-T y diluir la suspensión de micobacterias hasta la densidad celular deseada utilizando mediciones de RLU.
- Prepare diluciones seriadas diez veces del inóculo en placas de 24 pocillos utilizando PBS-T. Coloque 10 μL en placas de agar Middlebrook 7H11 (0,5% de glicerol, 50 μg/mL de higromicina, 10% de ácido oleico, albúmina, dextrosa, catalasa [OADC]) por duplicado para enumerar los recuentos de UFC de inóculo.
>2. Preparación de larvas de G. mellonella
- Compre las larvas del último estadio de fuentes apropiadas y manténgalas en la oscuridad a 18 °C a su llegada y utilícelas dentro de 1 semana después de la compra. Alternativamente, las larvas pueden ser autocriadas siguiendo el protocolo de Jojāo et al. En el caso de las larvas compradas, deseche las larvas muertas, descoloridas o en pupa antes de almacenarlas.
nota: Las larvas que pupan se distinguen morfológicamente de las larvas del último estadio.
- Identificar y seleccionar larvas sanas para experimentación, basándose en un color crema uniforme con poca o ninguna decoloración (melanización), tamaño (2-3 cm de longitud), peso (aproximadamente 250 mg), que muestren un alto nivel de motilidad y que posean la capacidad de enderezarse cuando se les da la vuelta.
- Cuente cuidadosamente las larvas sanas (mínimo de 20-30 por grupo) en una placa de Petri (94/15 mm) forrada con una capa de papel de filtro (94/15 mm) con pinzas de punta roma para minimizar la contaminación y almacene a temperatura ambiente en la oscuridad hasta su uso.
>3. Infectando G. mellonella con BCG lux
- Minimice el desorden dentro del MSC para reducir el riesgo de contaminación y lesiones por pinchazos con agujas.
- Prepare la plataforma de inyección pegando un papel de filtro circular (94 mm) a una superficie plana en relieve. Se pueden utilizar superficies blandas o duras que dependen totalmente de las preferencias del usuario, por ejemplo, las tapas de las cajas de pipetas o una esponja de nailon.
- Esterilice una microjeringa de 25 μL (25 G) aspirando 3 volúmenes de etanol al 70% y enjuague posteriormente con 3 volúmenes de PBS-T estéril.
- Aspire 10 μL de inóculo BCG lux (preparado en la sección 1) o PBS-T en la microjeringa esterilizada de 25 μL. Utilice una jeringa separada para el control de negativos de PBS-T.
nota: Vuelva a suspender el inóculo BCG lux después de 10 inyecciones para garantizar una suspensión celular uniforme.
- Use pinzas para levantar una larva y colocarla en la plataforma de inyección.
- En la plataforma, voltee la larva sobre su espalda e inmovilícela asegurando la cabeza y la cola con pinzas. Localice la última pata izquierda en cuenta regresiva desde la cabeza de la larva e inserte con cuidado la punta de la aguja (5-6 mm) en un ángulo de 10-20° con respecto al plano horizontal.
nota: Las pinzas cortas y estrechas permiten una fácil inmovilización con un estrés larvario mínimo. Preste atención a la sobrepenetración, que puede perforar el intestino y causar melanización o muerte no específica de BCG lux.
- Cuente las larvas infectadas en una placa de Petri forrada con una capa de papel de filtro, una sola placa de Petri de 90 mm puede acomodar hasta 30 larvas.
- Guarde la placa de Petri que contiene las larvas en una caja oscura ventilada o no sellada dentro de una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
>4. Seguimiento de la supervivencia de G. mellonella después de la infección
- A lo largo del tiempo, controle la supervivencia de las larvas cada 24 horas. Las larvas se consideran muertas cuando no se mueven en respuesta al tacto.
