NOTA: Todos los trabajos que se describen a continuación deben realizarse en un laboratorio CL2 dentro de una cabina de seguridad microbiológica (MSC) de clase 2 siguiendo las directrices locales de salud y seguridad.
1. Preparación de M. bovis BCG lux para la infección
- Descongele un stock congelado de glicerol (15%) de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) lux, la cepa de la vacuna de Montreal transformada con el plásmido lanzadera pSMT1 que lleva los genes luxAB de Vibrio harveyi que codifican la enzima luciferasa.
- Inocular 15 mL de caldo Middlebrook 7H9 que contiene 0,2% de glicerol, 10% de albúmina, dextrosa, enriquecimiento de catalasa (ADC) y 50 μg/mL de higromicina con una alícuota descongelada de 1,2 mL de BCG lux, en un matraz Erlenmeyer de 250 mL etiquetado.
- Colocar el matraz en un recipiente de bioseguridad sellado e incubar a 37 °C en una incubadora agitadora orbital a 220 rpm durante 72 h (o hasta que el cultivo alcance la fase media de crecimiento logarítmico).
- Compruebe el crecimiento del cultivo de BCG lux preparando diluciones 1:10 del cultivo en tubos luminómetros utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4, tampón de fosfato 0,01 M, cloruro de potasio 0,0027 M y cloruro de sodio 0,137 M) por duplicado. Vortex, y cargue los tubos del luminómetro en el luminómetro y mida la bioluminiscencia (unidad de luz relativa [RLU]/mL) utilizando aldehído n-decilo como sustrato (1% v/v en etanol absoluto).
NOTA: La proporción de RLU/unidades formadoras de colonias (UFC) se determinó previamente en 3:1 cuando BCG lux se cultivó in vitro en caldo Middlebrook 7H9.
- Centrifugar el cultivo a 2.175 x g durante 10 min a temperatura ambiente para granular las células y desechar el sobrenadante en un desinfectante adecuado con actividad micobactericida conocida. Deseche todos los residuos de cultivo con desinfectantes apropiados para micobacterias siguiendo las pautas locales.
- Lave el pellet de celda dos veces en PBS que contiene 0.05% de polisorbato 80 (PBS-T) para evitar la formación de grumos bacterianos.
- Después del lavado final, decantar el sobrenadante de desechos, volver a suspender el pellet de células micobacterianas en PBS-T y diluir la suspensión de micobacterias hasta la densidad celular deseada utilizando mediciones de RLU.
- Prepare diluciones seriadas diez veces del inóculo en placas de 24 pocillos utilizando PBS-T. Coloque 10 μL en placas de agar Middlebrook 7H11 (0,5% de glicerol, 50 μg/mL de higromicina, 10% de ácido oleico, albúmina, dextrosa, catalasa [OADC]) por duplicado para enumerar los recuentos de UFC de inóculo.
>2. Preparación de larvas de G. mellonella
- Compre las larvas del último estadio de fuentes apropiadas y manténgalas en la oscuridad a 18 °C a su llegada y utilícelas dentro de 1 semana después de la compra. Alternativamente, las larvas pueden ser autocriadas siguiendo el protocolo de Jojāo et al. En el caso de las larvas compradas, deseche las larvas muertas, descoloridas o en pupa antes de almacenarlas.
NOTA: Las larvas que pupan se distinguen morfológicamente de las larvas del último estadio.
- Identificar y seleccionar larvas sanas para experimentación, basándose en un color crema uniforme con poca o ninguna decoloración (melanización), tamaño (2-3 cm de longitud), peso (aproximadamente 250 mg), que muestren un alto nivel de motilidad y que posean la capacidad de enderezarse cuando se les da la vuelta.
- Cuente cuidadosamente las larvas sanas (mínimo de 20-30 por grupo) en una placa de Petri (94/15 mm) forrada con una capa de papel de filtro (94/15 mm) con pinzas de punta roma para minimizar la contaminación y almacene a temperatura ambiente en la oscuridad hasta su uso.
>3. Infectando G. mellonella con BCG lux
- Minimice el desorden dentro del MSC para reducir el riesgo de contaminación y lesiones por pinchazos con agujas.
- Prepare la plataforma de inyección pegando un papel de filtro circular (94 mm) a una superficie plana en relieve. Se pueden utilizar superficies blandas o duras que dependen totalmente de las preferencias del usuario, por ejemplo, las tapas de las cajas de pipetas o una esponja de nailon.
- Esterilice una microjeringa de 25 μL (25 G) aspirando 3 volúmenes de etanol al 70% y enjuague posteriormente con 3 volúmenes de PBS-T estéril.
- Aspire 10 μL de inóculo BCG lux (preparado en la sección 1) o PBS-T en la microjeringa esterilizada de 25 μL. Utilice una jeringa separada para el control de negativos de PBS-T.
NOTA: Vuelva a suspender el inóculo BCG lux después de 10 inyecciones para asegurar una suspensión celular uniforme.
- Use pinzas para levantar una larva y colocarla en la plataforma de inyección.
- En la plataforma, voltee la larva sobre su espalda e inmovilícela asegurando la cabeza y la cola con pinzas. Localice la última pata izquierda contando hacia atrás desde la cabeza de la larva e inserte con cuidado la punta de la aguja (5-6 mm) en un ángulo de 10-20° con respecto al plano horizontal.
nota: Las pinzas cortas y estrechas permiten una fácil inmovilización con un estrés larvario mínimo. Preste atención a la sobrepenetración, que puede perforar el intestino y causar melanización o muerte no específica de BCG lux.
- Cuente las larvas infectadas en una placa de Petri forrada con una capa de papel de filtro, una sola placa de Petri de 90 mm puede acomodar hasta 30 larvas.
- Guarde la placa de Petri que contiene las larvas en una caja oscura ventilada o no sellada dentro de una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
>4. Seguimiento de la supervivencia de G. mellonella después de la infección
- A lo largo del tiempo, controle la supervivencia de las larvas cada 24 horas. Las larvas se consideran muertas cuando no se mueven en respuesta al tacto.
>5. Medición de la carga in vivo de BCG lux en G. mellonella
- En cada punto de tiempo, seleccione al azar cinco larvas infectadas previamente preparadas en la sección 3 y esterilice suavemente las superficies de las larvas utilizando hisopos de bastoncillos de algodón empapados en etanol al 70%.
NOTA: Este paso es importante cuando se siembra el homogeneizado de larvas para la enumeración de UFC micobacterianas, ya que las larvas no esterilizadas pueden provocar contaminación.
- Colocar las larvas individualmente en tubos de matriz de lisado de 2 mL que contengan 800 μL de PBS estéril.
- Homogeneizar las larvas utilizando un homogeneizador durante 60 s a 6,0 m/s.
- Centrifugar los tubos de lisado a 3.500 x g durante 5 s para eliminar el homogeneizado de las tapas, y decantar cuidadosamente el homogeneizado en tubos de luminómetro estériles individualmente.
nota: Para la enumeración de UFC (paso 5.7), asegúrese de reservar 100 μL de homogeneizado en un tubo de reacción estéril de 1,5 mL.
- Recuperar el homogeneizado restante lavando los tubos de la matriz de lisis con 1 mL de PBS-T y pipetear en los tubos luminométricos correspondientes.
- Agite los tubos del luminómetro y mida la bioluminiscencia de los homogeneizados descritos anteriormente en el paso 1.4.
- Prepare diluciones seriadas diez veces del homogeneizado en placas de cultivo de 24 pocillos utilizando PBS-T. Colocar 10 μL de la dilución en placas de agar Middlebrook 7H11 que contienen 0,5% de glicerol, 50 μg/mL de higromicina, 10% de OADC y 20 μg/mL de piperacilina, para determinar la relación RLU/UFC de BCG lux después de la infección in vivo
NOTA: La piperacilina elimina la microbiota nativa de G. mellonella con una inhibición mínima del crecimiento de BCG lux.
