Un modelo de ratón con bolsa de aire para la recolección de exudado inflamatorio inducido por lipopolisacáridos

En este artículo

Resumen

Fuente: Lu, Q., et al. Detección de migración e infiltración de neutrófilos en ratones. J. Vis. Exp.(2020).

Este video describe el procedimiento para generar una bolsa de aire en el tejido subcutáneo de ratones y recolectar exudados inflamatorios en respuesta a la administración de lipopolisacáridos in vivo. Este video también cubre el análisis de la infiltración de neutrófilos en la bolsa de aire.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Ensayo de bolsa de aire

Primera inyección de aire
1. En el día 0, anestesiar completamente a los ratones con isoflurano al 5% durante 3 min en una cámara de anestesia gaseosa a una velocidad de 2 L/min, y mantener la anestesia de cada ratón en una sola unidad de respiración con isoflurano al 2% a una velocidad de 0,5 L/min.
  nota: Se garantiza una profundidad suficiente de la anestesia pellizcando los dedos de los pies antes de mover a los ratones de la cámara a la unidad de respiración única. Las piernas no deben moverse cuando se pellizcan los dedos de los pies.
2. Utilice un filtro de 0,22 μm conectado a una jeringa de 5 ml para obtener un volumen de 3 ml de aire esterilizado.
3. Levante la piel posterior del ratón anestesiado con pinzas e inyecte subcutáneamente 3 mL de aire esterilizado con una aguja de 26 G x 3/8".
4. Después del tratamiento, retire a los ratones de la unidad de respiración. Monitoree a los ratones para asegurarse de que estén vivos hasta que comiencen a moverse.
Segunda inyección de aire
1. El día 3, inyecte 3 mL adicionales de aire esterilizado en la bolsa de aire previamente establecida para sostener la bolsa de aire como se describe en la sección 1.1.
tratamiento
1. El día 6, 6 h antes del sacrificio, inyectar diferentes tratamientos en la bolsa de aire. Inyecte 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) como control negativo. Inyectar 1 mL de 1 μg/mL de LPS como control positivo para inducir inflamación local.
2. Anestesiar completamente ratones con isoflurano al 5% durante 3 min en una cámara de anestesia gaseosa a una velocidad de 2 L/min, y mantener la anestesia de cada ratón en una sola unidad de respiración con isoflurano al 2% a una velocidad de 0,5 L/min. Prepare el tampón de lavado de acuerdo con la Tabla de Materiales.
  nota: Se garantiza una profundidad suficiente de la anestesia pellizcando los dedos de los pies antes de mover a los ratones de la cámara a la unidad de respiración única. Las piernas no deben moverse cuando se pellizcan los dedos de los pies.
3. Para cada bolsa de aire, lave la bolsa de aire con 1 mL de tampón de lavado y recoja el exudado inflamatorio en un tubo de centrífuga de 15 mL. Lave la bolsa de aire con 2 ml de tampón de lavado 2 veces y recoja el exudado inflamatorio en el mismo tubo de centrífuga.
4. Centrifugar a 100 x g durante 10 min a RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 mL de tampón de lavado. Cuente las células para cuantificar la proporción de neutrófilos utilizando el analizador automático de hematología.
  nota: Vea los resultados representativos en la Figura 1.

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Resultados

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Figura 1: Resultados representativos del ensayo de la bolsa de aire. (A) Ilustración del ensayo de la bolsa de aire. (B) Resultados representativos de la infiltración de subconjuntos leucocitarios en el ensayo de bolsa de aire. PBS: control; LPS: 1 μg/mL LPS. Los datos se presentan como la media ± DE.