Cuantificación de la carga de Helicobacter pylori en el estómago de un ratón infectado

Resumen

Fuente: D'Costa, K. et al., Modelos de ratón de infección por Helicobacter y patologías gástricas. J. Vis. Exp. (2018)

En este video, describimos un protocolo para cuantificar la carga de Helicobacter pylori en tejidos estomacales de ratones después de la infección para confirmar su colonización.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Confirmación de la colonización bacteriana en el estómago después de la infección

1. Conteo viable de H. pylori en el estómago
   1. Complemente las placas estériles de HBA con antibióticos adicionales (200 μg/mL de bacitracina y 10 μg/mL de ácido nalidíxico) antes de realizar recuentos de colonias de estómagos de ratones infectados.
   2. Homogeneizar las secciones del estómago ya sea manualmente, utilizando micromorteros de polipropileno esterilizables en autoclave, o utilizando un instrumento de disociación mecánica (ver Tabla de Materiales).
   3. Preparar diluciones seriadas duplicadas (10⁻¹ a 10⁻²) de los homogeneizados gástricos resultantes en BHI.
      estériles nota: Las diluciones deben decidirse en función de las cargas bacterianas típicas obtenidas para una determinada cepa de H. pylori utilizada para la infección, así como de la duración de la infección. También se pueden utilizar muestras sin diluir.
   4. Divida las placas de HBA presecas (NOTA: Para garantizar el aislamiento de colonias individuales, las placas de HBA deben calentarse y secarse en una cabina de seguridad biológica o en una incubadora a 37 °C durante 10-15 minutos antes de su uso) en tres o cuatro segmentos. Utilizando una adaptación de la técnica de Miles y Misra, añadir 10-100 mL de cada dilución en un segmento de la placa de agar y extender con asas de plástico estériles.
   5. Deje que las placas se sequen y luego colóquelas en posición invertida (con la tapa hacia abajo) en frascos de gas anaerobio. Para mantener la humedad en los frascos, incluya una placa de Petri que contenga agua.
   6. Incubar los frascos a 37 °C hasta que se formen colonias (normalmente de 4 a 7 días).
   7. Enumere el (los) segmento (s) que contiene entre 10 y 100 colonias aisladas.
      NOTA: Las colonias de H. pylori y el crecimiento de H. felis en placas pueden distinguirse de los de otros miembros de la microbiota gástrica murina mediante las pruebas estándar de ureasa, catalasa y oxidasa. H. pylori y H. felis son positivos para las tres pruebas.
   8. Calcule las cargas bacterianas como (UFC/g de tejido), utilizando la siguiente fórmula:
      [(Número promedio de colonias contadas) × (factor de dilución) x (volumen plateado)]/(peso del estómago).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos bacteriológicos
Agar Sangre Oxoide Base No.2	Thermo Fischer Scientific	CM0271B	Disolver en agua desinonizada antes de la esterilización
Sangre de caballo desfibrilada de primera calidad	Biológicos Éticos Australianos	PDHB100
Caldo de infusión de corazón Bacto Brain	BD Biociencia	237500	Disolver en agua desinonizada antes de la esterilización
Paquetes de gas CampyGen	Thermo Fischer Scientific	CN0035A/CN0025A
antibióticos
vancomicina	Sigma Aldrich	V2002-1G	Disolver en agua desionizada
Polimixina B	Sigma Aldrich	P4932-5MU	Disolver en agua desionizada
Trimetoprima (≥98% HPLC)	Sigma Aldrich	T7883	Disolver en etanol 100% (absoluto)
anfotericina	Amresco (Astral Científico)	E437-100MG	Disolver en agua desionizada
Bacitracina de Bacillus licheniformis	Sigma Aldrich	B0125	Disolver en agua desionizada
Ácido naladíxico	Sigma Aldrich	N8878	Disolver en agua desionizada
Equipos y artículos de plástico
Frascos anaeróbicos Oxoid	Thermo Fischer Scientific	HP0011/HP0031
Pipetas COPAN Pasteur	Servicios Interpath	200CS01
Centrífuga Eppendorf 5810R			Recoja los gránulos bacterianos por centrifugación a 2.200 rpm durante 10 minutos a 4 °C
Parafilm M	Bemis, VWR	PM996
Micromortero Eppendorf para tubos de 1,2 - 2 mL	Sigma Aldrich	Z317314	Majas de polipropileno esterilizables en autoclave utilizadas para la homogeneización del estómago
Disociador de GentleMACs	Miltenyi Biotec	130-093-235	Utilice un programa gentleMACS preestablecido para el tejido estomacal del ratón
Tubos M (tapón naranja)	Miltenyi Biotec	30-093-236
Fluorímetro Qubit	Thermo Fischer Scientific	Pregunta 33216
Bucle de plástico estéril	LabServ	LBSLP7202