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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de catéteres
- Prepare una cánula pediátrica de acceso intravenoso para cada grupo de ratones que se infecten. Usando el mecanismo de resorte incorporado, retire cada cánula de su aguja, según las instrucciones del fabricante. Deseche las agujas, conservando solo la cánula intravenosa de plástico.
- Esterilice los catéteres en una campana de flujo laminar durante un ciclo de radiación ultravioleta (U.V.), generalmente de 25 a 30 min.
Nota: Los catéteres se pueden usar para más de un ratón, sin embargo, se debe usar un nuevo catéter entre grupos experimentales, sexos o cepas bacterianas.
>2. Preparación de E. coli uropatógena para la infección
- Al menos dos días antes de la infección, utilizando un asa de inoculación estéril, escurra UPEC de un caldo bacteriano congelado en una placa de agar Luria Broth (LB), que contenga antibióticos si corresponde. Incubar a 37 °C durante la noche. Las placas pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de una semana.
- En un matraz Erlenmeyer estéril de 100 ml, inocular 10 ml de LB, que contenga antibióticos si procede, con una sola colonia de la placa LB e incubar a 37 °C durante la noche (aproximadamente 16 - 18 h)
Nota: Los cultivos en pie permiten la expresión de pili tipo 1, que son necesarios para la infección. Los cultivos cultivados agitando tendrán una expresión de pili menos eficiente y, por lo tanto, tasas inconsistentes de infección.
- Mida la densidad óptica (DO)600 del cultivo nocturno y calcule el número de bacterias por ml utilizando una curva de crecimiento predeterminada. A modo de ejemplo, para la cepa UPEC UTI89, DE600 = 0,35 equivale a 2 x 108 UFC por ml, por lo tanto, un cultivo nocturno con un DE600 = 2,4 sería equivalente a 13,7 x 108 UFC por ml. Determinar empíricamente la relación entre el OD600 y las bacterias viables con cada nueva cepa empleada para la infección.
- Determine la cantidad de bacterias necesarias teniendo en cuenta el número de animales que se infectarán y que cada ratón debe recibir aproximadamente 107 unidades formadoras de colonias (UFC) en 50 μl de PBS. Incluya en el cálculo el volumen muerto de ~130 μl del catéter y la jeringa y los 100 μl necesarios para determinar el inóculo.
- Haga girar la suspensión bacteriana en una microcentrífuga de mesa a 17.000 x g durante 1 minuto y vuelva a suspender la pastilla bacteriana resultante a 2 x 108 UFC por ml en PBS. Diluir en serie una alícuota de esta suspensión y colocarla en agar LB, con antibióticos si corresponde, para determinar el inóculo exacto para cada infección.
- Extraiga el inóculo bacteriano en una jeringa de 1 ml y conecte el catéter al extremo de la jeringa. Golpee la jeringa para eliminar el aire y presione el émbolo para llenar el espacio de aire muerto en el catéter antes de comenzar la instilación.
>3. Preparación de ratones
- Anestesiar ratones mediante inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilacina. Se puede proporcionar calor suplementario.
- Asegúrese de que cada mouse esté completamente sedado apretando la almohadilla del pie con presión media. Los ratones están completamente sedados cuando no reaccionan y requieren de 3 a 5 minutos para alcanzar este estado.
- Coloque a los ratones en posición supina y aplique presión media en la parte inferior del abdomen para vaciar la vejiga de orina. Las vejigas llenas se sienten como un guisante debajo de la piel entre las crestas ilíacas.
Nota: El isoflurano inhalado se ha utilizado para cateterizar ratones hembra, sin embargo, no se ha probado si los ratones macho están suficientemente anestesiados por isoflurano inhalado para este procedimiento.
>4. Instilación transuretral de ratones machos
- Coloque dos pinzas para el pulgar craneal y caudalmente en los genitales externos del ratón. Retraiga el prepucio para exponer completamente el glande del pene. Una vez que el pene esté colocado externamente, suelte las pinzas del pulgar.
- Vuelva a colocar las pinzas para estabilizar el pene que sobresale perpendicular al animal, sosteniendo el órgano suave pero tensamente. Visualizar el meato uretral e introducir cuidadosamente el catéter en la pequeña abertura en la punta del órgano. Guíe suavemente el catéter dentro del pene, hacia el cuerpo del ratón, manteniendo una tensión suave con las pinzas. El catéter no requiere lubricación. No fuerce el catéter en el pene; El catéter debe deslizarse suavemente dentro de la uretra, lo que indica su ubicación correcta.
- Una vez que el centro del catéter se encuentra con la punta del pene, dispense muy lentamente 50 μl del inóculo, mientras mantiene la posición del pene. La calidad de la instilación se puede anotar en este momento de acuerdo con una puntuación de calidad de instilación predeterminada, como la que se muestra en la Figura 1.
- Retraiga el catéter lentamente, contando hasta 5, para evitar fugas del inóculo. Coloque a los ratones en sus jaulas en posición supina. Los animales deben comenzar a recuperarse 30 a 45 minutos después de la administración del anestésico.
