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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Análisis de citometría de flujo de tejido vesical
- Prepare un tampón de digestión que contenga colagenasa a 34 unidades/mL y DNasa a 100 μg/mL, en PBS. Mantener en hielo. Preparar un tubo cónico de 15 ml por animal a analizar y una alícuota de 1 ml de tampón de digestión por tubo.
- En puntos de tiempo predeterminados, sacrifique ratones utilizando procedimientos operativos estándar aprobados (por ejemplo, dislocación cervical o sobredosis de dióxido de carbono). Humedecer bien el abdomen con etanol al 70% para minimizar la contaminación por pelo.
- Haga una incisión en el tercio inferior del abdomen del ratón de al menos 2 cm con unas tijeras y extraiga toda la vejiga. Picar bien con unas tijeras, cortando la vejiga en trozos de 2 a 3 mm detamaño 2, normalmente unos 8 trozos.
- Agregue una vejiga picada por tubo que contenga tampón de digestión. Agite para lavar el tejido picado de la vejiga en el tampón de digestión. Manténgalo en hielo hasta que todas las vejigas estén diseccionadas y picadas.
- Incubar las vejigas picadas durante 60 - 75 min a 37 °C, agitando vigorosamente las manos durante 5 s cada 15 min. Cuando el pañuelo tiene una apariencia transparente vítrea, que se asemeja al papel de seda mojado, la digestión es completa. La digestión prolongada eliminará las proteínas de superficie de las células necesarias para la identificación y debe evitarse.
- Inactive las enzimas de digestión añadiendo 2 - 3 mL de tampón de citometría de flujo helado (PBS que contiene 2% de suero fetal bovino (FBS) y 0,2 mM de EDTA) y mezcle suavemente. Coloque los tubos en hielo.
- Para asegurar una suspensión unicelular y eliminar cualquier tejido conectivo, pase el contenido del tubo a través de un filtro de 100 μm colocado en un tubo cónico de 15 mL. Presione suavemente cualquier tejido restante a través del filtro con el extremo de un émbolo de jeringa. Lave el filtro con un tampón de citometría de flujo adicional de 2 mL. Mantenga las muestras en hielo.
- Lave las muestras por centrifugación durante 7 min a 200 x g, 4 °C. Vuelva a suspender los gránulos en un tampón de citometría de flujo de 100 μL que contenga un bloque de Fc, diluido a 5 μg/mL, y transfiéralo a una placa inferior redonda de 96 pocillos. Después de 10 a 15 minutos, agregue 100 μL del cóctel de anticuerpos deseado a cada muestra. Incubar las muestras durante 30 - 45 min, en hielo, protegidas de la luz.
nota: El bloqueo Fc es un reactivo utilizado para evitar la unión de la porción Fc de los anticuerpos a las células que expresan receptores Fc. Su propósito es minimizar la unión de anticuerpos inespecíficos. La determinación de los anticuerpos a utilizar dependerá de la hipótesis que se pruebe en el experimento y debe seleccionarse con la aportación de la bibliografía. En la Figura 1, para medir la infiltración general de células inmunitarias, se empleó un anticuerpo anti-CD45, que es una proteína de células paninmunes.
- Lave las muestras por centrifugación durante 7 min a 200 x g, 4 °C. Vuelva a suspender los gránulos de células en un tampón de citometría de flujo de 200 μL y pase las muestras a través de un filtro de células de 40 μm en un tubo de poliestireno de 5 ml justo antes de la adquisición en un citómetro de flujo.
- Recoja la muestra completa en el citómetro de flujo. Una buena digestión producirá de 200.000 a 400.000 células, con 8.000 a 10.000 células inmunitarias CD45+ de vejigas de ratón ingenuas, mientras que los órganos infectados contendrán más células (Figura 1)
nota: Las muestras preparadas para el análisis de citometría de flujo no se pueden utilizar para evaluar UFC. No se recomienda dividir la vejiga en dos partes, ya que no existe evidencia que demuestre que la colonización uropatógena por E. coli (UPEC) o la infiltración de células inmunitarias sea uniforme en todo el tejido.
