Una técnica para establecer un modelo de infección bacteriana en un cultivo de órganos ex vivo

Resumen

Fuente: Rizzuto, G. A., et al. Cultivos de placenta humana y órganos deciduales para estudiar infecciones en la interfaz materno-fetal. J. Vis. Exp. (2016)

Este video muestra un método para establecer un modelo de infección en tejidos placentarios para estudiar la propagación de la infección. Un cultivo de órganos placentarios ex vivo está infectado con Listeria monocytogenes, un parásito intracelular facultativo. Las bacterias invaden los trofoblastos extravellosos (EVT) para entrar en el tejido placentario y luego se propagan a otras células a través de la propagación de célula a célula.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Preparación de placas de cultivo de órganos

NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse utilizando una técnica estéril en una campana de cultivo de tejidos. Es ideal que el microscopio de disección se ubique en un campo estéril. Sin embargo, esto no es absolutamente necesario siempre que la microdisección se realice de manera expedita y los instrumentos se sumerjan con frecuencia en etanol al 70%.

1. Descongele los viales de matriz extracelular (MEC) en hielo. Diluya el ECM 1:1 con medios de recolección helados y mezcle mediante pipeteo. Pipetear lentamente para evitar la introducción de burbujas. Cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos requiere 100 μl de esta suspensión y puede albergar 3-4 cultivos de órganos.
2. Coloque los insertos transpocillos (tamaño de poro de 0,4 μM) en cada pocillo de la placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos.
3. Cubra cada inserto transwell con una capa fina (100 μl) de la suspensión ECM/media.
4. Coloque la placa en hielo e inmediatamente proceda al establecimiento de cultivos de órganos. Alternativamente, prepare la placa antes de la recolección de tejidos, en cuyo caso envuélvala en una película y guárdela a 4 °C para su uso posterior. No se recomienda el almacenamiento durante más de 6 horas, ya que el ECM se secará.

>2. Establecimiento de cultivos de órganos

NOTA: Este paso describe cómo colocar cultivos de órganos deciduales y cultivos de órganos vellosos en transpozos separados. Los tejidos no están en contacto. Los investigadores interesados en una técnica de cocultivo en la que la decidua y las vellosidades están en contacto directo entre sí pueden consultar la literatura previa.

1. Enjuague las muestras dos veces en los medios de recolección y centrifugue a 1.000 x g entre cada enjuague. Transfiera el tejido a una placa de Petri estéril y colóquelo en la platina de un microscopio de disección. Mantenga una placa de 6 pocillos en hielo junto al microscopio.
2. Microdiseccionar el tejido con tijeras de disección y pinzas estériles para establecer cultivos de órganos vellosos de 2-3 mm (Figura 1A).
   nota: Los cultivos de órganos vellosos son "árboles" pequeños y bien vascularizados con 2 o 3 ramas y con columnas prominentes de células trofoblásticas extravellosas (EVT). Es importante utilizar solo tejido velloso de las muestras del primer trimestre de <9 semanas, ya que la invasión de trofoblastos extravellosos en la MEC es más pronunciada en estas edades tempranas.
3. Seleccione vellosidades bien vascularizadas con columnas prominentes de células EVT. Las columnas de celda EVT se visualizan como extremos bulbosos, "difusos" y "esponjosos" (consulte las puntas de flecha en la Figura 1A).
4. Use pinzas estériles para transferir 3 o 4 árboles vellosos a cada transpozo. Ajuste las ramas para que el árbol se coloque plano sobre ECM y separe las ramas agrupadas.
5. Microdiseccionar tejido decidual con tijeras de disección y pinzas estériles, para establecer cultivos de órganos deciduales^{de 3 mm 3} (Figura 1A).
   nota: Los especímenes contienen dos tipos distintos de tejidos deciduales, decidua parietalis y decidua capsularis (fragmentos de tejido izquierdo y derecho, respectivamente, Figura 1A).
6. Recortar con unas tijeras para crear 3 piezas de decidua parietalis. La Decidua capsularis no se utiliza para estos cultivos. Use fórceps para extraer la sangre materna coagulada.
7. Use pinzas estériles para transferir 3-4 piezas de decidua en cada transpocillo.
8. Añada 1 ml de medio de recolección al fondo del pocillo. Incubar la placa durante la noche a 37 °C con 5% de CO₂.
9. Para los experimentos en los que es importante imitar la tensión normal de oxígeno de la placenta en el primer trimestre, mantener cultivos de órganos vellosos en hipoxia relativa (3% O₂).
   nota: Las opciones de laboratorio incluyen pequeñas cámaras de incubación de hipoxia que caben dentro de las incubadoras existentes o una incubadora de tres gases que introduce gas N₂ externo para reducir la concentración de oxígeno.
10. Añadir 1 ml de medio velloso o decidual (Tabla 1) en la parte superior del transpocillo después de 12-16 horas de cultivo.
    nota: La ausencia de medios durante la primera noche en cultivo permite que las columnas de células trofoblásticas extravellosas invadan (cultivo velloso) y que el tejido (tanto velloso como decidual) se incruste de forma segura en la MEC. En nuestra experiencia, los cultivos de órganos deciduales permanecen viables durante 72 horas y los cultivos de órganos vellosos durante 96 horas. Recomendamos criterios de valoración experimentales que se encuentren dentro de este período de tiempo. Véase la Tabla 1 para la composición del medio velloso y decidual. El medio velloso tiene un alto porcentaje de FBS, mientras que el medio decidual se complementa con hormonas del embarazo (progesterona, 17β-estradiol) que mantienen el estado decidualizado (Tabla 1).

>3. Preparación de cultivos de L. monocytogenes

NOTA: Para obtener un protocolo detallado sobre el almacenamiento a largo plazo de L. monocytogenes, y el cultivo y crecimiento de este organismo en caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) y agar, consulte Wang et al.

1. Elija una sola colonia de L. monocytogenes de una placa de agar BHI rayada e inocule 3 ml de caldo BHI.
2. Incubar el cultivo de L. monocytogenes durante la noche (16 h), en posición inclinada, a 30 °C.
   nota: Estas condiciones de cultivo permiten que el crecimiento bacteriano alcance la fase estacionaria. L. monocytogenes se flagela a 30 °C, lo que aumenta la invasión de la célula huésped.

>4. Infección de cultivos de órganos con L. monocytogenes

1. Caliente solución salina tamponada con fosfato (PBS) y medio velloso o decidual (Tabla 1) a 37 °C.
2. Utilice pinzas estériles para extraer cualquier pieza de cultivo de órganos que no haya invadido la MEC y que, por lo tanto, esté flotando en el pozo.
3. Aspire cuidadosamente los medios desde la parte inferior del transwell. Enjuague las pocillas superior e inferior dos veces pipeteando suavemente 1 ml de PBS tibio en el pocillo y aspirando cuidadosamente entre ellas. Pipetear suavemente 1 ml de medios vellosos o deciduales sin antibióticos en el transpocillo superior e inferior. Tenga cuidado de no perturbar el cultivo del órgano.
4. Deje que el tejido se incube en medios libres de antibióticos durante al menos una hora para asegurarse de que se hayan eliminado los antibióticos.
   nota: En la fase estacionaria, la densidad del cultivo de L. monocytogenes es de aproximadamente 1 x 10⁹ unidades formadoras de colonias (UFC) por ml. El número de bacterias utilizadas para infectar los cultivos de órganos debe determinarse empíricamente para satisfacer las necesidades experimentales.
5. En el caso de L. monocytogenes de tipo salvaje, los experimentos de infección rutinaria muestran una invasión robusta con una dilución de 1:50 durante la noche (4 x 10^{7 L}. monocytogenes en 1 ml de medio por pocillo). Vuelva a suspender el número adecuado de bacterias en un medio velloso o decidual libre de antibióticos.
6. Aspire los medios desde la parte superior de los transwells. Agregue suavemente 1 ml de inóculo. Incubar las placas a 37 °C con 5% de CO₂ para permitir la invasión bacteriana.
7. Elimine las bacterias extracelulares mediante la aspiración de medios de los pozos superiores e inferiores. Enjuague los pocillos dos veces con PBS tibio. Añadir 1 ml de medios Vellosos o Deciduales suplementados con 50 μg ^ml-1 de Gentamicina. Placas de incubación a 37 °C en 5% CO₂.
   NOTA: L. monocytogenes es una bacteria intracelular facultativa que puede crecer en un medio extracelular, crecer dentro de las células y propagarse de célula a célula sin acceder al espacio extracelular. La gentamicina tiene un efecto bactericida sobre L. monocytogenes extracelular y, por lo tanto, permite medir el crecimiento intracelular de L. monocytogenes y su diseminación a través del cultivo de órganos.
   nota: La infección reproducible por L. monocytogenes de cultivos de órganos vellosos y deciduas ocurre con tiempos de incubación de 5 horas. El tiempo de incubación antes de la adición de gentamicina puede modificarse en función de las necesidades experimentales y de la capacidad del organismo para invadir el tejido. Para comprender mejor los sitios anatómicos más vulnerables a la infección, se pueden utilizar tiempos de incubación más cortos.
8. Mantenga las placas a 37 °C con 5% de CO₂ durante todo el experimento. Cambie todos los medios de cada pozo diariamente.
   nota: En nuestra experiencia, los cultivos de órganos deciduales infectados por L. monocytogenes permanecen viables durante 48 horas y los cultivos de órganos vellosos durante 72 horas.

Tabla 1: Recetas de medios. Componentes y concentraciones para la preparación de tampón de lavado, medio de recolección, medio velloso y medio decidual

Tampón de lavado	Medio de recolección	Vellosidad media	Medio decidual
Pbs	DMEM/F-12 con GlutaMAX	DMEM/F-12 con GlutaMAX	DMEM/F-12 con GlutaMAX
Penicilina 100 UI/ml	Suero Fetal Bovino 2.5%	Suero Fetal Bovino 20%	Suero Fetal Bovino 2.5%
Estreptomicina 100 μg/ml	Penicilina 100 UI/ml	Penicilina 100 UI/ml	17β-estradiol 300 pg/ml
Gentamicina 50 μg/ml	Estreptomicina 100 μg/ml	Estreptomicina 100 μg/ml	Progesterona 20 ng/ml
Anfotericina B 1,25 μg/ml	Gentamicina 50 μg/ml
	Anfotericina B 1,25 μg/ml

Resultados

Figura 1: Cultivos de órganos vellosos: imágenes macroscópicas y microscópicas representativas.

(A) Dos árboles vellosos terminales con una edad gestacional de 6 semanas, vistos bajo un microscopio de disección. Obsérvense los extremos "esponjosos" (puntas de flecha) y la prominente vasculatura fetal que recorre las ramas del árbol de la i...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bolsas de esterilización	Fisher Científico	01-812-54	Para el autoclave de herramientas de disección individuales
Colador de malla fina	Cuisinart (Amazon.com)	Na	Envuelva completamente en papel de aluminio y autoclave antes de la recolección de pañuelos.
Garrafón con espiga	Fisher Científico	03-007-647	Para la preparación de grandes volúmenes de tampón de lavado.
Bolsas de hielo	Laboratorios Nortech	GB8818	Estos no tienen que ser comprados, sino que pueden ser reciclados/reutilizados de cualquier envío rutinario de laboratorio que los incluya en el embalaje.
70% Etanol	VWR	V1001	Solución al 70% hecha agregando dH20 a alcohol de grado de investigación de 190 o 200 grados.
10% Lejía	Suministro sanitario Waxie	CLO 30966	Solución al 10% mediante la adición de dH20.
Caja de luz	Litebox Lumina (dickblick.com)	55305-2009	Nota: Las bombillas de repuesto también se compran en Blick (55305.0100)
Pinzas de microdisección	Guardando	52102-43	4 pulgadas, 1x2 0,5 mm, ligera curva
Pinzas de microdisección	Guardando	52102-06	4 pulgadas, recto fino, afilado
Tijeras de resorte de vannas micro diseccionadoras	Guardando	52130-01P	Tijeras de muelle McPherson-Vannas, 8,5 cm, punta de 0,33, ligera curva
Microscopio de disección	Microsistemas Leica	MZ16 o M60	Hemos tenido éxito con los modelos enumerados. Las fuentes de luz flexibles externas de cuello de cisne son útiles, pero no necesarias.
Tubos cónicos de 50 mL	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS4558
Solución salina tamponada con fosfato	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10010023	Compramos en nuestras instalaciones universitarias de Tissue Culture Core, hay opciones alternativas como esta disponibles.
10X solución salina tamponada con fosfato	Teknova	P0195	Para la preparación del tampón de lavado utilizamos 10X PBS
Mezcla de nutrientes DMEM/F-12 (Jamón) con GlutaMAX	Gibco (Tecnologías de la Vida)	10565-018	Compramos esta formulación de medios específica, que contiene 2,438 g/L de bicarbonato de sodio, 55 mg/L de piruvato de sodio y 4,5 g/L de glucosa
gentamicina	Thermofisher Científico	15710072	Stock de 1000X. Se recomienda preparar y almacenar las alícuotas a -20 °C para evitar la congelación/descongelación.
Penicilina/Estreptomicina	Gibco (ThermoFisher Scientific)	Números 15140-122	Stock 100X. Se recomienda preparar y almacenar las alícuotas a -20 °C para evitar la congelación/descongelación.
Anfotericina B	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15290-018	Stock 500X. Se recomienda preparar y almacenar las alícuotas a -20 °C para evitar la congelación/descongelación.
progesterona	Sigma-Aldrich	P8783	Se elabora una solución madre de 1 mM reconstituyendo 15,7 mg de polvo de progesterona en etanol de 15,7 mL y añadiendo 34,3 mL de PBS. La solución se filtra estérilmente, se alícuota y se almacena a -20 °C.
17β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Se elabora una solución madre de 10 μM reconstituyendo 13,5 mg de polvo de estradiol en 10 mL de etanol y añadiendo 40 mL de PBS. La solución se filtra estérilmente, se alícuota y se almacena a -20 °C.
Filtro de vacío con tapa de botella (0,22 μm)	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS430769	Para la filtración estéril de los medios de recolección después de la preparación
Placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Halcón BD	353224	Poliestireno, Cultivo de tejidos tratado
Transpozos de 6 pocillos	Millipore	PICM03050	Inserto: membrana de PTFE hidrófilo de 30 mm de diámetro, tamaño de poro de 0,4 μm
Matriz extracelular (por ejemplo, matriz Matrigel)	BD Biociencias	354234	Hemos utilizado la Matriz Matrigel en nuestros estudios. Es un sólido a temperatura ambiente y a -20 °C. Evite la congelación/descongelación repetida. Descongele el frasco hasta la solución viscosa a 4 °C y prepare alícuotas de ~ 300 μL en la cámara frigorífica con puntas de pipeta refrigeradas. Almacenar las alícuotas a -20 °C.
Paraformaldehído, 16% p/v solución acuosa	Alfa Aesar	30525-89-4	Para la fijación de tejidos, se realiza una preparación fresca de paraformaldehído al 4% diluyendo este caldo en PBS.
Incubadora de cultivo de tejidos, mantenida a 37 °C, 5% de CO2, 3% de oxígeno (opcional para cultivos de órganos vellosos)			Para algunos experimentos, se puede preferir la hipoxia. Esto se puede establecer de múltiples maneras, incluida la adición de nitrógeno exógeno a través de un cilindro de gas, una tubería Tygon y un regulador.
Centrífuga de sobremesa