Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>PRECAUCIÓN: Trabajar con muestras de sangre humana y parásitos de la malaria humana requiere medidas de precaución. Siempre use una bata de laboratorio y guantes, y trabaje en un gabinete de bioseguridad de nivel 2. En caso de exposición percutánea accidental a la malaria humana, informar a Salud y Seguridad para recibir tratamiento profiláctico. También se deben tener en cuenta consideraciones de seguridad adicionales para trabajar con sangre VIH(+) del virus de la inmunodeficiencia humana. Usa una bata de laboratorio que cierre hacia atrás. Doble guante (el guante superior debe ser de látex). Realizar toda la manipulación en una cabina de Bioseguridad de nivel 2. No utilice vidrios ni objetos punzantes. No utilice un aspirador. Coloque todos los artículos contaminados en una solución de virox o lejía durante un mínimo de 1 hora antes de desecharlos. Lave todas las superficies con virox y ultravioleta (UV) durante 1 hora después de su uso. Tenga en cuenta que cada institución tendrá sus propias normas específicas de bioseguridad que deben seguirse. Reporte todas las exposiciones accidentales a sangre infectada por el VIH a Salud y Seguridad para su evaluación y consideración de la posible profilaxis posterior a la exposición.
>Nota: Existen diferentes cepas de parásitos de la malaria por P. falciparum. Para estos experimentos se utilizó ITG, pero se pueden utilizar diferentes cepas. En el sitio web de MR4 se encuentran disponibles excelentes instrucciones sobre la congelación y descongelación de parásitos Plasmodium falciparum.
1. Creación de RPMI-A para el cultivo de parásitos de la malaria
- Haga RPMI-0 mezclando 950 ml de agua bidestilada (ddH2O), 1 paquete de polvo Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, 6 g de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfónico (HEPES), 2 g de bicarbonato de sodio y 1,35 mg de hipoxantina.
- Descongele el suero humano inactivado por calor de dos donantes diferentes. Los donantes AB son los mejores, pero se puede usar cualquiera si los parásitos crecen en glóbulos rojos (RBC) de tipo O. Invierta los tubos para mezclar. Si el suero contiene material particulado o es espeso, centrifugar a 2.000 rpm y luego filtrar la porción líquida con una unidad de filtro de 0,45 μm.
- Utilizando una unidad de filtro de 0,2 μm, filtre 180 ml de RPMI-0, 20 ml de suero humano (10 ml de cada donante) y 0,5 ml de gentamicina de 10 mg/ml.
nota: El suero humano puede obstruir el filtro, por lo que es posible que se requiera más de una unidad de filtro.
- Etiquete el frasco mediano con RPMI-A, la fecha y la fuente del suero. Refrigere hasta que se requiera. El RPMI-A puede volverse turbio cuando se refrigera. Esto es normal, pero el aumento de la nubosidad es un signo de contaminación.
nota: El crecimiento de los parásitos puede variar en los diferentes sueros de los donantes. Es una buena idea analizar todos los lotes de suero humano para ver si tienen un buen crecimiento de parásitos antes de usarlos.
>2. Preparación de glóbulos rojos humanos para el cultivo de parásitos
>Nota: Los donantes de sangre deben ser del tipo O.
- Recoja de 7 a 10 ml de sangre en tubos de citrato-ácido dextrosa (ACD). Escriba la identificación del donante y la fecha de recolección en la etiqueta.
- Almacene la sangre a 4 oC hasta que la necesite. Use sangre para cultivos de parásitos dentro de 1 mes.
- Limpie la parte superior del tubo con etanol al 70%. Retire con cuidado el tapón y deséchelo. Transfiera la sangre a un tubo de 15 ml. Girar durante 3 min a 1.000 x g. Extraer el plasma por aspiración.
- Suspenda los glóbulos rojos con un volumen igual de RPMI-0 caliente. Girar durante 5 min a 1.000 x g. Retirar la capa leucocitaria por aspiración, volver a suspender en 5 ml de RPMI-0 y repetir el lavado 2 veces más.
- Retire el sobrenadante y agregue suficiente RPMI-A para producir una mezcla que sea 50% de glóbulos rojos por volumen.
- Almacene a 4 o Chasta que lo necesite.
>3. Mantenimiento de los cultivos de parásitos
- Precalentar RPMI-A a 37 oC.
- Coloque los parásitos descongelados (consulte el protocolo MR4 para el procedimiento de descongelación) en un matraz T25 con 5 ml de RPMI-A y 75 μl de glóbulos rojos humanos lavados para un hematocrito de ~ 3%. nota: El hematocrito mide el volumen de glóbulos rojos en comparación con el volumen total. Para calcular el hematocrito, mida el volumen de glóbulos rojos empaquetados con respecto al volumen total del medio más glóbulos rojos. Supongamos que los parásitos descongelados aportarán 75 μl de glóbulos rojos. Al añadir 150 μl de caldo de glóbulos rojos (lo que equivale a añadir 75 μl de glóbulos rojos empaquetados) al matraz, se obtiene un total de 150 μl de glóbulos rojos en 5 ml de medio, lo que equivale a un hematocrito del 3% (150 μl/5.000 μl x 100% = 3%).
- Gasifique el matraz durante 30 segundos con una mezcla de gases parásitos (1% O2, 3% CO2, balance N2). Selle y coloque el matraz con el lado ancho hacia abajo en una incubadora de 37 oC para permitir la mayor superficie para el intercambio de gases.
- Para cambiar el medio y comprobar si hay parasitemia (debe hacerse a diario), mueva con cuidado el matraz para no alterar la capa de glóbulos rojos. Con una pipeta Pasteur estéril y desenchufada, extraiga el medio de cultivo sin alterar la capa de sangre.
- Para controlar la parasitemia, extraiga una muestra de 10 μl de la capa de sangre, colóquela en un portaobjetos de vidrio y, con un segundo portaobjetos de vidrio, cree una película de sangre delgada. Deje que el portaobjetos se seque.
- Colocar 4 ml de RPMI-A fresco en el matraz, mezclar suavemente, gasear durante 30 segundos y colocar en una incubadora a 37 °C.
- Tiñir el portaobjetos con el kit de tinción Hema3 según el protocolo del fabricante.
- Para una tinción óptima, sumerja los portaobjetos en la solución de fijación durante 10 segundos, la solución I durante 10 segundos y la solución II durante 30 segundos. Enjuague con agua y deje que los portaobjetos se sequen.
- Calcule la parasitemia contando el número de glóbulos rojos de Plasmodium falciparum, PfRBC (teñidos de púrpura oscuro) frente al número total de glóbulos rojos (teñidos de rosa). Cuente un total de 300 celdas para garantizar la precisión.
- Cuando los parásitos hayan alcanzado una parasitemia del 5%, se amplíe el cultivo en un matraz T75, utilizando 40 ml de RPMI-A y 500 μl de glóbulos rojos.
>4. Sincronización de parásitos
>Nota: El día antes del experimento, sincronice el cultivo del parásito tratándolo con alanina. Solo los parásitos en etapa anillo y los glóbulos rojos no infectados sobrevivirán a este tratamiento. La sincronización de alanina le dará un cultivo de trofozoíto puro al día siguiente que se puede utilizar en los experimentos de cocultivo. Asegúrese de comenzar con un cultivo de parásitos que contenga la mayoría de los parásitos en etapa anular.
- Prepare la solución de alanina mezclando 8,01 g de alanina (300 mM) y 0,365 g de Tris (10 mM) en 300 ml de ddH2O. Lleve el pH a 7,4. Esterilización por filtro con una unidad de filtro de 0,2 μm.
- Precalentar la solución de alanina a 37 oC.
- Centrifugar el cultivo de parásitos (5 min x 1.000 x g) y retirar el medio.
- Vuelva a suspender el pellet en 19 volúmenes de solución de alanina (1 ml de RBC empaquetado por 19 ml de solución de alanina). Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Centrifugado 5 min x 1.000 x g. Aspirado sobrenadante. Lavar en RPMI-0 una vez. Aspirar el sobrenadante y resuspender en RPMI-A y ajustar el hematocrito a ~3%. Matraz de gas y retorno a 37 oC.
nota: Para los experimentos de cocultivo, se necesita una parasitemia mínima del 5% de trofozoítos, considerándose óptimo el 10% de parasitemia.
>5. Preparación de parásitos y glóbulos rojos para experimentos de cocultivo
- Utilice una proporción de 3 PfRBC por PBMC en experimentos de cocultivo para inducir una respuesta inflamatoria. Para calcular el PfRBC total, se cuantifique la parasitemia mediante un frotis de sangre fino como se describe en 3.5, y el hematocrito contando el número de glóbulos rojos por ml de cultivo de parásitos utilizando un hemocitómetro.
Número de glóbulos rojos = % de parasitemia x glóbulos rojos totales/ml x ml de cultivo. Por ejemplo, 10 ml de cultivo a 10 x 106 RBC/ml y 10% de parasitemia es igual a 0,1 x 106/ml x 10 ml = 10 x 106 PfRBC.
- Centrifugar el cultivo de parásitos durante 5 min a 1.000 x g (RT). Aspirar medio y resuspender a 6 x 106 PfRBC por ml en RPMI-S+ (500 ml de RPMI-1640 suplementado con L-glutamina y HEPES, 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor, 1,5 ml de gentamicina, 5 ml de piruvato de sodio 100 mM, 5 ml de aminoácidos no esenciales MEM de 10 mM, 5 ml de β-mercaptoetanol de 5 mM).
- Tome sangre de control (glóbulos rojos no infectados del mismo donante utilizado para mantener el cultivo de parásitos), calcule el hematocrito y vuelva a suspender en RPMI-S+ con el mismo número de glóbulos rojos por ml que el cultivo de parásitos.
>6. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC)
- Recolectar sangre venosa en tubos de heparina sódica (tapa verde) tanto de un donante crónico de VIH(+) como de un grupo de control de VIH(-). No utilice el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante, ya que la acción quelante del calcio del EDTA afecta a la función celular. En promedio, espere entre 5-10 x 106 PBMC por 10 ml de sangre. Para un experimento típico, recoja 30 ml de sangre de cada donante. El volumen de sangre deberá ajustarse de acuerdo con los requisitos experimentales.
- Tan pronto como sea posible y definitivamente dentro de una hora después de la recolección de sangre, retire la sangre de los tubos y colóquela en un tubo de plástico de 50 ml. Los monocitos, en particular, se activarán y se adherirán al vidrio, por lo que es importante que si se utilizan tubos de extracción de sangre en vidrio, las células se extraigan lo más rápido posible.
- Centrifugar la sangre a 1.000 x g durante 15 minutos y recoger plasma (esto se puede utilizar para otros estudios si es necesario; si no, se puede omitir este paso). Diluya la sangre en un volumen igual de solución salina fría tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
- Coloque 15 ml de RT Ficoll en un tubo de 50 ml. Lentamente, utilizando una pipeta de transferencia de plástico estéril, coloque la solución de sangre/DPBS sobre el Ficoll sin mezclarlo. Se puede colocar un máximo de 25 ml de solución de sangre/DPBS sobre cada 15 ml de Ficoll.
- Gira los degradados durante 30 minutos en RT a 600 x g. Asegúrate de que la opción "sin freno" esté activada.
- Una vez que las células hayan girado, busque la interfaz entre las dos fases. Aquí es donde están los PBMC. Con una pipeta de transferencia de plástico estéril, recoja la PBMC de la interfaz (consulte la figura 1). Minimice la contaminación por glóbulos rojos.
- Coloque las células recolectadas en tubos de 50 ml, con no más de 20 ml por tubo. Tubo superior de hasta 50 ml con DPBS frío estéril.
- Girar las celdas durante 10 min a 4 oC a 300 x g.
- Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 5 ml de DPBS frío estéril y agrupe todas las células del mismo donante en un tubo. Rellene hasta 50 ml con DPBS estéril y repita los pasos de lavado 2 veces más.
- Vuelva a suspender las células en 10 ml de medio RPMI-S+.
- Retirar una alícuota de 20 μl y mezclar con 20 μl de azul de tripano. Pipetear 10 μl en un hemocitómetro y contar las células vivas (células que no han absorbido el tinte azul; todas las células azules están muertas). Use un hemocitómetro para calcular el número de células en una solución de la siguiente manera.
nota: Un hemocitómetro tiene una cuadrícula de dimensiones especificadas para que se conozca el área cubierta por las líneas.
- Asegúrese de que el hemocitómetro esté limpio. Coloque el cubreobjetos sobre el área de conteo. Cargue 10 μl de solución celular colocando la punta de la pipeta en uno de los pocillos en forma de V. El área debajo del cubreobjetos se llenará por capilaridad.
- Coloque el hemocitómetro cargado bajo un microscopio. La rejilla completa del hemocitómetro contiene 9 cuadrados de 1 mmy 2 cada uno. Cuenta todas las celdas dentro de cada cuadrado grande. Si hay demasiadas células presentes, diluya más la solución y vuelva a contar.
- Calcule la concentración de células de la siguiente manera: Total de células/ml = (total de células contadas/# de cuadrados) x factor de dilución x 10.000 células/ml, por ejemplo, (500 células/5 cuadrados) x factor de dilución de 20 x 10.000 células/ml = 20 x 106 células en total.
- Ajuste el medio a una concentración final de 10 x 106 por ml (medio RPMI-S+).
>7. Cultivo de coinfección malaria/VIH
- Placa de 100 μl de PBMC aisladas y 400 μl de medio RPMI-S+ en una placa de 24 pocillos (1 x 106 PBMC por pocillo). Asegúrese de que los pocillos estén configurados por triplicado: 3 pocillos para glóbulos rojos no infectados, 3 pocillos con glóbulos rojos no infectados, 3 pocillos con medio y 3 pocillos con PMA/ionomicina. Esto es tanto para las muestras de VIH(+) como para las muestras de VIH(-).
- Para los pocillos de PfRBC, colocar 3 x 106 PfRBC en cada uno de los pocillos (500 μl de cultivo de parásitos preparado en 5.2).
- En el caso de los pocillos de glóbulos rojos no infectados, colocar 500 μl del cultivo de glóbulos rojos no infectados preparado en 5.3 en cada uno de los pocillos.
- Para pocillos medianos, coloque 500 μl de medio RPMI-S+ en cada uno de los pocillos.
- Para los pocillos de PMA/ionomicina, prepare una solución de PMA/ionomicina (2,5 pg/ml, 250 pg/ml respectivamente). Coloque 500 μl de esta solución en cada pocillo.
nota: Como potentes estimuladores de la secreción de citocinas de las células T, PMA e ionomicina se utilizan como controles positivos para garantizar que las células sean funcionales.
- Coloque la placa a 37 oC en una incubadora de 5% de CO2.
- Opcional: utilice el exceso de células para el análisis fenotípico mediante citometría de flujo o almacene en una solución de estabilización de ARN para futuros análisis de expresión de ARNm.
>8. Detección de respuestas inmunitarias a la malaria
>Nota: Realice experimentos de co-cultivo durante hasta 4 días. No se requiere ningún cambio de medio durante este tiempo. El punto de tiempo óptimo dependerá del tipo de celda de interés y de la pregunta formulada. Una incubación de 12-48 h es óptima para las respuestas monocíticas a los PfRBC, mientras que las respuestas de los linfocitos se observaron mejor a las 72-96 h. Los puntos de tiempo deberán optimizarse en función de la pregunta experimental. Se pueden utilizar períodos más cortos (2-4 horas) si la interacción entre PfRBC intacta y PBMC es de interés.
- Plato giratorio a 300 x g durante 3 min para pellets celdas. Recoja 700 μl de sobrenadante de cultivo de cada pocillo.
- Centrifugar el sobrenadante a 1.000 x g durante 5 min para eliminar cualquier residuo.
- Alícuota del sobrenadante aclarado según sea necesario, etiquetado y congelación por debajo de -20 °C hasta que se realice el análisis de los factores secretados.
