Inducción de la enfermedad de injerto contra huésped en modelos de ratón mediante trasplante alogénico de médula ósea y células esplénicas

Resumen

Fuente: Buchele, V., et al. Inducción de la enfermedad intestinal de injerto contra huésped y su evaluación miniendoscópica en ratones vivos. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra la inducción de la enfermedad de injerto contra huésped intestinal, EICH, en un ratón receptor irradiado letalmente utilizando células madre hematopoyéticas alogénicas y linfocitos T aloreactivos esplénicos inductores de EICH. Este protocolo ayuda a establecer un modelo de EICH intestinal aguda grave para comprender el mecanismo de la enfermedad y desarrollar opciones terapéuticas innovadoras.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Inducción de GvHD

1. Día 0: Irradiación corporal total de los ratones receptores
   1. Utilice ratones hembra CD45.2+ H2kd+ BALB/c que tengan al menos 10 semanas de edad como receptores.
   2. Pesar y registrar el peso de los ratones receptores antes de la inducción de EICH.
      nota: Asegúrese de que el recipiente tenga un peso corporal mínimo de 20 g. El peso corporal inicial servirá como valor de referencia para calcular la pérdida de peso de cada ratón a lo largo de la inducción y progresión de la EICH.
   3. Coloque hasta cinco ratones en el recipiente del irradiador de rayos X.
   4. Irradiar los ratones por irradiación corporal total con una dosis única de 8 Gy de rayos X. Utilice Cs137 como fuente de radiación.
2. Día 1: Reconstitución de los ratones irradiados con médula ósea empobrecida en células T
   nota: El trasplante de células alogénicas de médula ósea, tal como se describe y detalla en la sección 1.2, debe realizarse dentro de las 24 horas posteriores a la irradiación. Realice los procedimientos que se describen a continuación en una campana de cultivo de tejidos estéril y utilice reactivos filtrados. Utilice CD45.1/Ly5.1 B6 alogénico. Ratones SJL-Ptprca Pepcb/BoyCrl como donantes de médula ósea con depleción de células T.
   1. Eutanasia CD45.1/Ly5.1 B6. Ratones SJL que donarán células alogénicas de médula ósea de acuerdo con las directrices institucionales, 12-24 h después de la irradiación de los ratones receptores BALB/c. Para ello, anestesiar el CD45.1/Ly5.1 B6. Ratones SJL por inhalación de isoflurano al 5%. Continuar con la exposición al isoflurano más de 1 min después de la parada respiratoria y confirmar la eutanasia por luxación cervical.
   2. Desinfecte a fondo el pelaje y la piel del ratón con etanol al 70%.
   3. Coloque el ratón sobre una funda de trabajo limpia de modo que el ratón quede en posición prona, con los cuartos traseros mirando hacia el experimentador. Levante el pelaje en el talón de Aquiles con la punta de unas pinzas Semken de 13 cm de longitud y puntas curvas dentadas. Incidir la piel entre las pinzas y el talón con unas tijeras finas endurecidas de 8,5 cm con puntas rectas.
   4. Elongar la incisión cranealmente (es decir, desde el talón sobre la parte inferior de la pierna y el muslo hasta la región de la cadera). Retira la piel y el pelaje de la extremidad trasera con la ayuda de las pinzas.
   5. Realice el mismo procedimiento en la otra extremidad trasera.
   6. Retire las extremidades traseras cortando las articulaciones adyacentes de la cadera.
   7. Corta las patas traseras. Corta a través de la articulación de la rodilla. Guarde el muslo y la pierna de cada extremidad trasera juntos en una placa de Petri de 92 mm llena de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en hielo.
   8. Limpie los huesos del fémur y la tibia con cuidado eliminando la mayor cantidad posible de tejido muscular de cada muslo y vástago. Transfiera los huesos del fémur y la tibia a un tubo de 50 ml lleno de medio estéril RPMI 1640 y colóquelo sobre hielo húmedo hasta que todos los huesos de la tibia y el fémur recolectados en el paso 1.2.7 se limpien del tejido muscular.
   9. Para aislar la médula ósea, transfiera un fémur o hueso de la tibia a la vez (que se haya limpiado como se describe en el paso 1.2.8) del tubo de 50 ml a una placa de Petri (con un diámetro de 92 mm) llena de medio RPMI 1640. Cortar los extremos del fémur o la tibia con un bisturí para acceder a la cavidad del hueso que contiene la médula ósea.
   10. Prepare un tubo de recolección de 50 mL con 5 mL de medio RPMI 1640. Inserte una aguja de 26 g conectada a una jeringa de 1 mL llena con 1 mL de medio RPMI 1640 en la cavidad ósea y enjuague la médula ósea fuera de la cavidad en el tubo de recolección empujando el émbolo.
   11. Repita el paso 1.2.10 hasta que el hueso se vea claro y brillante (es decir, la cavidad ósea esté visiblemente desprovista de médula ósea rojiza). Deseche el hueso vacío.
   12. Repita los pasos 1.2.9 a 1.2.11, utilizando todos los huesos del fémur y la tibia del paso 1.2.8, y recoja todas las piezas de médula ósea recuperadas en el mismo tubo de recolección de 50 ml del paso 1.2.10. Mantenga el tubo de recolección sobre hielo húmedo hasta que todos los huesos del paso 1.2.8 se hayan procesado en consecuencia.
   13. Cree una suspensión de una sola célula pipeteando suavemente las piezas de médula ósea enrojecidas y desmenuzables hacia arriba y hacia abajo. Filtre la suspensión unicelular de médula ósea a través de un filtro de células de malla de 40 μm colocado en un nuevo tubo de recolección de 50 mL.
   14. Centrifugar el tubo de recolección de 50 mL que contiene la suspensión unicelular de médula ósea a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
   15. Vuelva a suspender el pellet en 5 mL de tampón de lisado ACK (1 mM Na²EDTA; 10 mM KHCO₃; 144 mM NH₄Cl; pH 7,2) para la lisis de glóbulos rojos. Incubar la suspensión celular durante 3 minutos a temperatura ambiente. Después, añada inmediatamente 10 ml de solución de PBS a la suspensión celular.
   16. Centrifugar la suspensión a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 2 mL de solución de PBS.
   17. Cuente las células de la médula ósea con un hemocitómetro. Conserve una alícuota de 6 x 10⁶ células para el análisis de citometría de flujo para comprobar la pureza de las células después de la purificación celular (ver paso 1.2.20).
   18. Para el agotamiento de las células T de la suspensión unicelular de la médula ósea, utilice un kit de purificación celular disponible en el mercado. Agotamiento magnético de las células CD90.2+ (es decir, linfocitos) de las células totales de la médula ósea, siguiendo el protocolo del fabricante.
   19. Cuente las células de médula ósea deplecionadas con células T que se han aislado como se describe en el paso 1.2.18, utilizando un hemocitómetro. Conserve una alícuota de 1 x 106 células para el análisis de citometría de flujo que se realizará más adelante, como se describe en el paso 1.2.20.
       nota: El rendimiento celular promedio derivado de un ratón donante suele ser de 2 x 107 a 3,4 x 107 células de médula ósea con depleción de células T.
   20. Confirme una depleción exitosa de células T mediante citometría de flujo. Teñir 1 x 10⁶ células, conservadas de los pasos 1.2.17 (células de la médula ósea antes de la separación magnética de células) y 1.2.19 (células de médula ósea empobrecidas por células T después de la separación magnética de células), con los siguientes anticuerpos: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) y α-CD8α (53-6.7). Utilice las celdas restantes del paso 1.2.17 como control sin tinción y para controles de tinción única, para configurar el citómetro de flujo.
       1. Transfiera 1 x 10⁶ células de cada muestra a un pocillo de una placa de 96 pocillos con un fondo en V para realizar el procedimiento de tinción por citometría de flujo.
       2. Centrifugar las células dentro de la placa de 96 pocillos (paso 1.2.20.1) a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 μL de tampón FACS (PBS suplementado con suero bovino filtrado al 3%).
       3. Centrifugar las celdas dentro de la placa de 96 pocillos a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
       4. Añadir una cantidad adecuada del anticuerpo elegido (comparar con el paso 1.2.20) a las muestras para la tinción única en 100 μL de tampón FACS.
       5. Prepare una mezcla de todos los anticuerpos (mezcla maestra) que contenga las cantidades adecuadas suficientes para teñir por separado las alícuotas de las células de médula ósea conservadas de la depleción de células T magnéticas anteriores (véase el paso 1.2.17) y posteriores (véase el paso 1.2.19). Agregue 100 μL de la mezcla maestra a ambas alícuotas.
       6. Añada solo 100 μL de tampón FACS a la muestra sin teñir.
       7. Incubar las células dentro de la placa de 96 pocillos durante 20 minutos a 4 °C en la oscuridad.
       8. Añada 100 μL de tampón FACS y centrifugue las células dentro de la placa de 96 pocillos a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 μL de tampón FACS.
       9. Centrifugar las células a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 250 μL de tampón FACS.
       10. Transfiera las muestras a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL y analícelas con un instrumento de citómetro de flujo que sea capaz de detectar las moléculas fluorescentes que se utilizaron para marcar los anticuerpos empleados para caracterizar las muestras celulares (ver paso 1.2.20).
       11. Compare la composición de la célula antes y después de la separación magnética de la célula
           nota: Por lo general, se logra una pureza de aproximadamente el 95% de las células CD45.1 + CD3- (es decir, médula ósea agotada en células T) dentro de la puerta viva.
   21. Lavar las suspensiones de células de médula ósea empobrecidas con linfocitos T 2 veces con solución de PBS (450 x g durante 5 min a 4 °C) y, finalmente, resuspender las células en solución de PBS, ajustando la concentración celular a 5 x 10⁷ células/mL. Mantenga las células en hielo húmedo hasta la inyección.
   22. Inyectar células de médula ósea deplecionadas con linfocitos T en los ratones receptores, que fueron irradiadas el día anterior (ver sección 1.1).
       1. Coloque el ratón experimental en una cámara a prueba de fugas e induzca la anestesia por inhalación de hasta un 4% de isoflurano, hasta que el ratón quede inconsciente. Confirmar la analgesia y la pérdida de conciencia mediante la prueba de la pérdida del reflejo de enderezamiento y la posterior pérdida del reflejo de retirada del pedal.
       2. Inyecte 5 x 10^{6 células} de médula ósea con depleción de células T (es decir, 100 μL de 5x10⁷ células/mL) que contengan solución de PBS utilizando una jeringa de 1 mL equipada con una aguja de 30 G por vía intravenosa en el espacio retrobulbar que contiene el seno venoso.
3. Día 2: Transferencia de linfocitos T
   nota: Realice los procedimientos descritos a continuación en una campana de cultivo de tejidos estéril y utilice reactivos filtrados. Utilice CD45.2 C57Bl/6 (tipo salvaje; WT) como donantes de linfocitos T aloreactivos. El uso de sistemas de marcadores congénitos permite distinguir entre los tipos de células hematopoyéticas receptoras (ratones CD45.2+ H2kd+ Balb/c) y donantes (células de médula ósea: CD45.1+ H2kb+ B6). ratones SJL; Células T alogénicas: ratones CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6).
   1. Eutanasiar ratones C57Bl/6 de acuerdo con las directrices y autoridades institucionales aplicables. Por lo tanto, anestesiar a los ratones por inhalación con una concentración de isoflurano al 5%. Continuar la exposición al isoflurano hasta 1 min después de la parada respiratoria y confirmar la eutanasia por luxación cervical. Desinfecte a fondo el pelaje y la piel del ratón con etanol al 70%.
   2. Coloque un colador con una pantalla de malla de 40 μm en un tubo de recolección de 50 mL. Retire el bazo y colóquelo en el colador.
   3. Con un émbolo de jeringa, triture el bazo en el colador. Lave el colador y el émbolo de la jeringa con PBS para recoger todos los esplenocitos.
   4. Centrifugar las células dentro del tubo de recolección de 50 mL a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
   5. Vuelva a suspender los esplenocitos en 3 mL de tampón de lisado ACK para lisar los glóbulos rojos. Incubar la suspensión celular durante 3 min. A continuación, añadir 10 mL de PBS y centrifugar las células a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los esplenocitos en PBS.
   6. Cuente las células del bazo con un hemocitómetro. Desvíe una alícuota de 6 x 10⁶ células para el análisis de citometría de flujo, para evaluar la magnitud de la purificación en el paso 1.3.9.
   7. Para un aislamiento total de células T CD3+ de los esplenocitos totales, utilice un kit de purificación celular disponible en el mercado. Aísle las células T esplénicas, siguiendo el protocolo del fabricante.
   8. Cuente las células T CD3+ esplénicas aisladas como se describe en el paso 1.3.7, utilizando un hemocitómetro. Conserve una alícuota de 1 x 10⁶ células T para el análisis de citometría de flujo.
      nota: El rendimiento promedio de células T esplénicas por ratón donante aislado por separación magnética de células oscila entre 1,3 x 10⁷ y 2 x 10⁷ células.
   9. Confirmar el éxito del aislamiento de células T mediante citometría de flujo. Para obtener una descripción detallada del protocolo de tinción, consulte y siga los pasos 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Teñir 1 x 10⁶ esplenocitos de los pasos 1.3.6 (antes de la separación de células magnéticas) y 1.3.8 (después de la separación de células magnéticas) con los siguientes anticuerpos: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) y α-CD8α (53-6.7).
      2. Utilice las células restantes del paso 1.3.6 como control sin tinción y para la tinción única con los anticuerpos respectivos, para configurar el citómetro de flujo.
      3. Compare la composición de las células antes y después de la separación magnética de las células.
         nota: Se debe lograr una pureza del ≥95% de las células T CD45.2 + CD3+ dentro de la puerta viva de los linfocitos.
   10. Lavar las células T 2 veces con PBS (450 x g durante 5 min a 4 °C) y, por último, resuspender las células en solución de PBS, ajustando la concentración de células a 7 x 10⁶ células/mL. Mantenga las células en hielo hasta la inyección.
   11. Inyecte linfocitos T esplénicos aloreactivos (ver paso 1.3.10) en ratones BALB/c irradiados que hayan recibido previamente células de médula ósea con depleción de linfocitos T CD45.1+ (ver paso 1.2.22).
       1. Inducir la anestesia colocando al ratón experimental en una cámara a prueba de fugas en la que se le expone hasta un 4% de isoflurano hasta que pierda el conocimiento. Confirmar la analgesia y la pérdida de conciencia mediante la prueba de la pérdida del reflejo de enderezamiento y la posterior pérdida del reflejo de retirada del pedal.
       2. Inyectar 0,7 x 10^{6 linfocitos} T CD3+ aloreactivos utilizando una jeringa de 1 mL equipada con una aguja de 30 G (es decir, 100 μL de 7 x 10⁶ células/mL) que contenga solución de PBS (ver paso 1.3.10), por vía intravenosa en el espacio retrobulbar de los ratones, para inducir la EICH. Denominar a estos ratones como el grupo experimental.
       3. Inyectar a un grupo diferente de ratones con 100 μL de PBS solo, por vía intravenosa, en el espacio retrobulbar, y denominar a este grupo como el grupo de control, posteriormente llamado "ratones sin células T trasplantadas (noT)".

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Irradiador gamma BIOBEAM 2000	Gamma-Service Meical GmbH
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Pinzas Semken (longitud: 13 cm; puntas dentadas y curvas)	Herramientas de Bellas Ciencias	11009-13
Tijeras finas endurecidas (longitud: 8,5 cm; puntas rectas; filo: 24 mm)	Herramientas de Bellas Ciencias	14090-09
RPMI-1640 Medio	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Aguja hipodérmica (26G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
Jeringa de 1 ml	B. Braun Melsungen AG	9166017V
Tubo de 50 mL	Sarstedt Ag & Co.KG	6,25,47,254
Colador de células con pantalla de malla de 40 μm	Halcón BD	352340
Jeringa de insulina con interior estéril (30G)	Bd	324826
Kit de aislamiento de células T Pan II, ratón	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	Separación de células magnéticas para aislar células T esplénicas
CD90.2 MicroBeads, ratón	Miltenyi Biotec GmbH	Teléfono 130-049-101	Separación de células magnéticas para aislar las células de médula ósea agotadas por las células T
Pinzas de biopsia	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	Parte de la configuración experimental de la colonoscopia
Ácido etilendiaminotetraacético, sal disódica dihidratada (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingrediente del tampón de lisado ACK
Anticuerpo Alexa Fluor 700 anti-ratón CD45.2 (clon: 104; lote: B252126; RRID: AB_493731)	Bioleyenda	109822
Anticuerpo PE/Cy7 anti-ratón CD45.1 (clon: A20; lote: B217246; RRID: AB_1134168)	Bioleyenda	110730
Anticuerpo CD8a anti-ratón APC/Cy7 (clon: 53-6.7, lote: B247008; RRID: AB_312753)	Bioleyenda	100714
Forano / Isoflurano	AbbVie Inc.	B506
Suero bovino filtrado	Pan Biotec	P40-47500	ingrediente del tampón FACS