>1. Purificación in vitro de esporozoítos de ooquistes de C. parvum
- Purifique los esporozoítos de los ooquistes de C. parvum después de blanquear y lavar la lejía como se describe anteriormente.
- Transfiera los ooquistes a un tubo de 15 mL. Resuspender los ooquistes en medio de extracción a temperatura ambiente (0,75% p/v de taurocolato de sodio en DMEM) para obtener 1 x 107 ooquistes/mL. La adición de taurocolato mejora la tasa de excitación de los ooquistes, mejorando el rendimiento de esporozoítos.
- Incubar la suspensión de ooquistes a 37 °C durante 1-1,5 h.
- Revise la muestra microscópicamente para determinar el grado de excystation; 60-80% de excystation es razonable para una buena recuperación de esporozoítos. Si el nivel de excystation es bajo, incubar durante más tiempo (otros 30 min a 1 h).
- Determine el porcentaje de excystation en relación con el número de ooquistes iniciales. La excystation se calcula como:
% de excitación = [1 – (número de ooquistes intactos/número de ooquistes al inicio)] x 100
- Lave las células para eliminar los reactivos de excitación añadiendo 14 mL de PBS o medio, mezclando y recuperando las células (ooquistes intactos, cubiertas de ooquistes y esporozoítos) por centrifugación a 3.400 x g durante 20 min para recuperar los esporozoítos. Aspire con cuidado para evitar la pérdida de células.
- Vuelva a suspender el pellet de esporozoíto en 1-2 mL de DMEM para obtener 3 x 107 ooquistes/mL (según el número de ooquistes iniciales).
- Para eliminar los ooquistes y cáscaras restantes, filtre la suspensión a través de un filtro de 3 μm (Figura 1B). Utilice un aparato portafiltros de 47 mm equipado con un filtro de policarbonato (tamaño de poro de 3 μm) unido a un cilindro de jeringa de 10 ml. Coloque el aparato portafiltros encima de un tubo de 15 mL. Coloque el conjunto en una cubitera o en una cámara frigorífica.
- Agregue 7,5 mL de la suspensión de esporozoíto al conjunto del filtro y deje que se filtre por gravedad. Lavar con otros 7,5 mL de DMEM.
nota: Para garantizar el éxito en el aislamiento de esporozoítos, es fundamental disponer de ooquistes frescos y de una buena excitación. Si hay demasiados ooquistes sin excystir, la suspensión no fluirá por gravedad. La aplicación de presión sobre la jeringa puede forzar el paso de los ooquistes no exquistes. La microinyección de esporozoítos es más difícil que la de los ooquistes porque los esporozoítos pueden agruparse y bloquear el capilar. Para evitarlo, se recomienda hacer una punta capilar más ancha al inyectar organoides con esporozoítos. Para lograr niveles suficientes de infección, es necesario inyectar de 2 a 4 veces el número de esporozoítos en cada organoide en comparación con los organoides infectados con ooquistes.
- Centrifugar la suspensión de esporozoíto filtrado a 3.400 x g utilizando un rotor de cubo oscilante durante 20 min para pellizar esporozoítos.
- Vuelva a suspender en 50-100 μL de medio de cultivo de organoides OME u OMD (consulte la Tabla de Materiales) suplementado con un 0,05% (p/v) de colorante Fast Green y L-glutatión, betaína, L-cisteína, ácido linoleico y tampón reductor que contiene taurina (consulte la Tabla de Materiales)
nota: La incubación de ooquistes durante demasiado tiempo puede provocar la lisis de los esporozoítos y una mala recuperación, por lo que debe evitarse.
>2. Cultivo in vitro de intestino humano para microinyección
- Cultivo de organoides intestinales en condiciones de medios de expansión y diferenciación.
NOTA: Los detalles de la propagación intestinal se han descrito previamente en otros artículos (consulte la Tabla de materiales para recetas de medios). Aquí, describimos brevemente el método de cultivo de organoides con referencia específica a la optimización para la inyección y el crecimiento de Cryptosporidium. Hemos encontrado que para la obtención de imágenes de parásitos en organoides, los organoides cultivados en un medio de expansión son preferibles a los cultivados en un medio de diferenciación, ya que hay menos acumulación de desechos que la observada en los organoides cultivados en un medio de diferenciación. Sin embargo, si el objetivo es aislar ooquistes, los organoides cultivados en medios de diferenciación producen un número mucho mayor de ooquistes.
- Mantener los organoides en cultivos 3D en matriz extracelular (ver la Tabla de Materiales) a 37 °C. Añadir OME (medios de expansión de organoides) encima y refrescar cada día.
- Para dividir y colocar organoides en placa para microinyección, retire los medios de la placa de 6 pocillos que contiene organoides humanos, agregue F12+++ (consulte la Tabla de materiales) al pocillo y rompa la matriz pipeteando con una punta de pipeta de 1 ml varias veces. Recoja las células en un tubo de 15 mL (2 mL de F12+++ por tubo son suficientes para procedimientos posteriores).
- Agregue 10-12 mL de F12+++ en otro tubo de 15 mL y coloque una pipeta de vidrio pulido al fuego en el medio, pipetee hacia arriba y hacia abajo 3 veces para romper los organoides intestinales humanos.
nota: Utiliza una pipeta de vidrio larga (20-30 cm) y pule al fuego brevemente. No haga la abertura (1 mm de diámetro) muy pequeña porque los organoides pueden dañarse. Alisa la punta de la pipeta puliéndola brevemente al fuego. Rompe los organoides en pedazos más pequeños de ~50 μm.
- Agregue F12+++ hasta 5–7 mL y centrifugue a 350 x g durante 5 min.
nota: La velocidad de centrifugación en este paso es más alta de lo normal para hacer un buen pellet celular que esté bien separado de la matriz extracelular (ver Tabla de Materiales). Hemos observado que, en comparación con los organoides del intestino delgado de ratón, los organoides del intestino delgado humano son más difíciles de alterar.
- Retire la mayor cantidad de medio posible sin alterar las células, luego vuelva a suspender el pellet con la matriz mantenida a 4 °C; se requieren 200-300 μL de matriz por pocillo de una placa de seis pocillos. Los organoides deben dividirse uno en tres para mantener una densidad celular bastante alta.
- Coloque los organoides en gotas de matriz de aproximadamente 5 a 10 μL cada una en el pocillo de una placa de seis pocillos. Incubar durante 20-30 min a 37 °C y luego añadir medio de expansión (OME) encima.
- Cambie el medio cada 2-3 días.
nota: En unos 5-7 días, los organoides que crecen en EM alcanzan un tamaño de 100-200 μm y están listos para la inyección.
- Para diferenciar los organoides, después de 5-6 días en EM, cambie el medio a condiciones de medio de diferenciación (MS) y manténgalo durante 5-6 días adicionales antes de inyectar los parásitos.
nota: Para la expansión de los organoides, se recomienda colocar los organoides en una placa densa. Para la microinyección, se recomienda el uso de una placa de seis pocillos con organoides sembrados a una densidad menor. Por ejemplo, la placa de organoides de tres pocillos de una placa de seis pocillos en una placa completa de seis pocillos para microinyecciones. La matriz debe mantenerse a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo y descongelarse a 4 °C o en hielo antes de su uso.
>3. Microinyección de ooquistes/esporozoítos en la luz del organoide
- Microinyecte parásitos en el lado apical del organoide 3D (Figura 2).
- Prepare capilares de vidrio de 1 mm de diámetro con un extractor de micropipetas.
nota: Los ajustes utilizados en el extractor de micropipetas (consulte la tabla de materiales) son Calor = 663, Tracción = 100, Velocidad = 200, Tiempo = 40 ms. La configuración deberá ajustarse de acuerdo con las instrucciones del usuario para una máquina en particular.
- Corta la punta del capilar con pinzas. El tamaño/diámetro del extremo capilar mide aproximadamente 9-12 μm; Esto permite un fácil flujo de ooquistes (tamaño de 4-5 μm).
- Llene los capilares con suspensión de ooquistes o esporozoítos utilizando puntas de microcargador.
- Cargue el capilar lleno de ooquistes en un microinyector.
- Microinyecte una suspensión de 100-200 nL en cada organoide bajo un microscopio invertido con un aumento de 5x, manteniendo la presión constante. Después de la microinyección, refresque los medios con OME u OMD (medio de diferenciación de organoides) todos los días y mantenga la placa a 37 °C.
nota: No utilizamos un micromanipulador para la microinyección. Se recomienda el uso del mismo capilar durante todo el experimento para garantizar una inyección igual en cada muestra.
