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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Infección
- Infecte mosquitos Anopheles stephensi con Plasmodium berghei ANKA alimentándolos durante 15 minutos con un ratón gametocitémico. Mantener los mosquitos infectados a 80% de humedad y 21 °C.
- Recoja los mosquitos hembra de su jaula de 17 a 22 días después de la ingesta de sangre. Colócalos en hielo para anestesiarlos.
- Con fórceps, coloque tres o cuatro mosquitos en un portaobjetos de vidrio cubierto con una gota de medio RPMI frío. Coloque el portaobjetos bajo un microscopio.
- Con pinzas, estire cuidadosamente el mosquito entre la cabeza y el cuerpo. Aísle la glándula salival con una jeringa y una aguja. Repita este procedimiento con los mosquitos restantes.
- Recoja las glándulas salivales del portaobjetos de vidrio aspirándolas con una pipeta de vidrio y recojándolas en un tubo de centrífuga de 1,5 mL.
nota: Dependiendo de las tasas de infección, por lo general se pueden obtener de 8,000 a 15,000 esporozoítos infecciosos por glándula salival.
- Durante aproximadamente 3 minutos, aplaste las glándulas salivales aisladas dentro del tubo de centrífuga con un pequeño palito de plástico para aislar los esporozoítos del tejido de la glándula salival.
- Centrifugar durante 3 min a 1.000 x g y 4 °C para purificar los esporozoítos del tejido restante.
- Pipetear el sobrenadante, que contiene los esporozoítos (SPZ), en un nuevo tubo de centrífuga y contar los esporozoítos purificados en un hemocitómetro de Neubauer.
- Ajuste la concentración de esporozoítos purificados a 10.000/mL añadiendo solución salina tamponada con fosfato.
- Inyectar un total de 1.000 esporozoítos (0,1 mL) en las venas de la cola de ratones C57BL/6 endogámicos para iniciar la infección. Para facilitar las inyecciones, coloque los ratones C57BL/6 en un retenedor y coloque las colas en agua tibia (aproximadamente 37 °C) para ayudar con la visualización de las venas de la cola><.
nota: La inyección en sí es un procedimiento corto que se puede realizar en unos pocos segundos.
- Una vez al día, controle la parasitemia en la sangre en frotis de sangre desde el día 3 en adelante después de la infección por SPZ.
- Evalúe a los ratones una vez al día con la puntuación de la Escala Rápida de Coma y Comportamiento Murino (RMCBS), a partir del día 5 después de la inyección de esporozoíto.
- Evalúe a los ratones con imágenes de resonancia magnética (IRM) de acuerdo con la puntuación de la Escala Rápida de Coma y Comportamiento Murino (RMCBS) y la pregunta de investigación a abordar.