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>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Macrófagos de lavado broncoalveolar (BAL)
- Utilice BAL para obtener macrófagos pulmonares en (1) sujetos humanos mediante broncoscopia y (2) ratones mediante aspiración intratraqueal.
nota: La adquisición de los macrófagos generalmente provoca cierta activación de estas células. Los macrófagos se obtienen de pacientes que requieren una broncoscopia para investigar un posible problema médico y no todos los sujetos pueden ser adecuados para el análisis de trampas extracelulares de macrófagos, o MET (esto deberá determinarse para cada proyecto individual).
- Tome la solución de BAL y gírela hacia abajo (500 x g durante 10 min) para formar un pellet, lave dos veces con medio de cultivo (medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 5% de suero fetal de ternero y 1% de L-glutamina) a temperatura ambiente, y luego diluya las células en 4 mL de medio de cultivo.
- Si es necesario, solicite un conteo diferencial formal; la mayoría de las células (generalmente >80%) serán macrófagos.
nota: Por lo general, esto lo realizará un servicio de histología clínica utilizando el aspecto morfológico de los diferentes tipos de células.
- Realice un recuento de células de macrófagos viables en la solución de BAL utilizando exclusión de azul de tripano y un hemocitómetro.
nota: La solución de LBA se obtiene de humanos y ratones, como se mencionó en el paso 1.1.
- Agregue 1 - 4 x 105 macrófagos a placas de 24 pocillos en cubreobjetos en 500 μL de medio de cultivo por pocillo y déjelo toda la noche a 37 ° C; las células se adherirán a los cubreobjetos. Para muestras humanas, agregue antibióticos (por ejemplo, penicilina y estreptomicina, 104 U/mL) para prevenir la contaminación bacteriana.
>2. Marcaje de inmunofluorescencia/microscopía de macrófagos BAL
>NOTA: Las celdas se adhieren a los cubreobjetos como se mencionó anteriormente.
- Retire el medio de cultivo y lave las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Fije las células en un fijador de paraformaldehído/periodato/lisina (PLP) al 2% durante 10 min.
- Lave las células brevemente en PBS y luego permeabilice al 0,2% Tween 20 en PBS durante 20 min.
- Bloquee las células con un 10% de sueros de pollo en albúmina sérica bovina (BSA) al 5% diluida en PBS durante 30 min.
- Incubar con anticuerpos primarios y de control de isotipo durante 1 h a temperatura ambiente a concentraciones de 1:100 (se enumeran detalles más específicos en la Tabla de Materiales) a 37 °C.
nota: Para las muestras de BAL, generalmente no se requiere un marcador específico de macrófagos.
- Después de la adición de anticuerpos primarios, lavar las células en PBS e incubar con los anticuerpos secundarios correspondientes durante 40 minutos a temperatura ambiente.
- Lave las secciones en PBS y móntelas con un medio de montaje basado en DAPI para su visualización utilizando un microscopio confocal (como se mencionó anteriormente) con excitaciones láser de 405, 488, 561 y 647 nm y un objetivo de aceite 40X, 1.0 NA.