1. Inoculación en aerosol con una suspensión de conidios de M. grisea
- Cultivo de hongos para M.grisea
- Prepare el medio de cultivo de avena y tomate agar (OTA) para cepas de hongos.
- Pesar de 30 a 50 g de avena, agregar esto a 800 mL de agua destilada/desionizada (ddH2O) y hervir la mezcla durante 30 min en la olla eléctrica.
- Filtra el jugo de avena hervido en el vaso de precipitados a través de un trozo de gasa.
- Añadir 150 mL de zumo de tomate y 20 g de agar al filtrado en el vaso de precipitados y añadir ddH2O hasta 1.000 mL.
- Preparación de materiales experimentales
- Remojar unas 50 semillas de arroz (Oryza sativa) cultivar Lijiangxintuan-heigu (LTH) en ddH2O durante 3 días o remojar unas 50 semillas de cebada (Hordeum vulgare cv Golden Promise) en ddH2O durante aproximadamente 1 día.
- Envuelva las semillas de arroz o cebada en una gasa húmeda y germine en papel de filtro húmedo en unas 30 placas de Petri con un diámetro de 10 cm x 10 cm a 28 °C. El tiempo de germinación de la semilla de arroz es de aproximadamente 2 a 3 días y el tiempo de germinación de la semilla de cebada es de aproximadamente 2 días. La humedad relativa en el invernadero es de aproximadamente el 70%.
- Plante las plántulas de arroz o cebada en macetas con tierra para macetas y riego esterilizados en autoclave y luego cúbralas con una capa de vermiculita.
- Coloque las plantas en un invernadero o gabinete de crecimiento adecuado a 25 °C durante aproximadamente 1 ~ 2 semanas.
- Corta 3 capas de papel de filtro en círculos con tijeras quirúrgicas estériles (cada círculo debe tener un diámetro de 8 cm) y colócalas en placas de plástico estériles de 100 mm.
- Agregue ddH2O a cada plato para empapar el papel de filtro.
- Asegúrese de que el papel de filtro esté completamente mojado, pero no agregue agua adicional.
- Elimine el exceso de agua con una bomba de vacío.
- Coloque 2 palillos de dientes estériles en la placa de cultivo para sostener las hojas de arroz / cebada; separe los palillos de dientes a ~ 2 - 3 cm.
- Recoja las hojas del arroz 2 semanas después de sembrar las semillas o tome las hojas de la cebada 7 días después de sembrar las semillas.
- Usando plántulas de arroz / cebada de 4 a 6 hojas, corte la parte inferior del tallo a ~ 5 cm de la parte superior y recoja las hojas.
- Protocolo de inoculación por pulverización
- Cultive la cepa fúngica en placas OTA en una incubadora termostática (25 °C) durante ~4 d.
- Agregue ~ 2 mL de ddH2O con una pipeta de 0,5 a 5 mL a cada placa de 4 días.
- Con un asa de inoculación, raspe los micelios de la cepa silvestre de M. grisea y la cepa mutante en los restos de micelios.
- Recoja los restos de micelio y transfiéralos a una nueva placa OTA. Tome los restos de micelio y séquelos con secador en el banco limpio.
- Cubra la placa con 3 capas de gasa para garantizar la humedad necesaria para el crecimiento de los conidios en un invernadero a 25 °C durante el día (14 h) y 23 °C por la noche (10 h) durante 24 a 48 h.
- Agregue 2 mL de ddH2O a cada plato y raspe los conidios suavemente con hisopos de algodón estériles, seguido de una filtración a través de 2 capas de papel para lentes. Tenga cuidado de no rayar la superficie del medio de cultivo.
- Transfiera la suspensión de conidios a un nuevo tubo de 50 ml con una pipeta de 100 a 1.000 μl.
- Centrifugar durante 5 min a un mínimo de 5.000 x g a 25 °C.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet para obtener 2 x 104 conidios por ml en una solución Tween-20 al 0,025% (v/v). La solución Tween-20 suele ser de unos 10 a 20 ml.
- Vierta la suspensión de esporas en un rociador manual.
- Esterilizar unos 10 mL de la suspensión conidial sobre las hojas de arroz de plántulas de arroz de 2 semanas de edad o las hojas de cebada de plántulas de cebada de 7 días de edad e incubarlas a 25 °C en una cámara oscura y húmeda durante ~24 h. Rociar las plantas de control con la solución Tween-20 al 0,025% (v/v).
- Transfiera las hojas a otra cámara húmeda bajo luz fluorescente a 25 °C durante un fotoperíodo de 12 h.
- Registre los síntomas de la enfermedad a los 5 días después de la inoculación. Examine las hojas de arroz/cebada enfermas de ~ 6 cm de longitud. El estándar de evaluación es de acuerdo con el sistema de puntuación de resistencia a explosiones del Instituto Internacional de Investigación del Arroz (IRRI). Los detalles del sistema de puntuación para la resistencia a la explosión se muestran en la Tabla 1.
- Fotografiar las hojas para evaluar la infección de las cepas analizadas. La infección se evaluó por el número de lesiones por 3,6cm2.
Tabla 1: Un sistema de puntuación para la resistencia a las explosiones. La tabla es una cita del Instituto Internacional de Investigación del Arroz (IRRI).
| escama | descripción |
| 1 | Pequeñas motas marrones del tamaño de un alfiler |
| número arábigo | Pequeñas manchas grises necróticas, redondeadas a ligeramente alargadas, de aproximadamente 1-2 mm de diámetro, con un margen marrón distintivo. Las lesiones se encuentran principalmente en las hojas superiores |
| 3 | El tipo de lesión es el mismo que en 2, pero un número significativo de lesiones se encuentran en las hojas superiores |
| 4 | Lesiones típicas de blastos susceptibles, de 3 mm o más, que infectan menos del 4% del área foliar |
| 5 | Lesiones típicas de blastos susceptibles, de 3 mm o más, que infectan menos del 4-10% del área foliar |
| 6 | Lesiones típicas de blastos susceptibles, de 3 mm o más, que infectan menos del 11-25% del área foliar |
| 7 | Lesiones típicas susceptibles a blastos, de 3 mm o más, que infectan menos del 26-50% del área foliar |
| 8 | Lesiones típicas de blastos susceptibles, de 3 mm o más, que infectan menos del 51-75% del área foliar, muchas hojas muertas |
| 9 | Las lesiones típicas susceptibles a los blastos, de 3 mm o más, infectan más del 75% del área foliar |
