>1. Cultivo de hongos para M.grisea
- Prepare el medio de cultivo de avena y tomate agar (OTA) para cepas de hongos.
- Pesar de 30 a 50 g de avena, agregar esto a 800 mL de agua destilada/desionizada (ddH2O) y hervir la mezcla durante 30 min en la olla eléctrica.
- Filtra el jugo de avena hervido en el vaso de precipitados a través de un trozo de gasa.
- Añadir 150 mL de zumo de tomate y 20 g de agar al filtrado en el vaso de precipitados y añadir ddH2O hasta 1.000 mL.
>2. Preparación de materiales experimentales
- Remojar unas 50 semillas de arroz (Oryza sativa) cultivar Lijiangxintuan-heigu (LTH) en ddH2O durante 3 días o remojar unas 50 semillas de cebada (Hordeum vulgare cv Golden Promise) en ddH2O durante aproximadamente 1 día.
- Envuelva las semillas de arroz o cebada en una gasa húmeda y germine en papel de filtro húmedo en unas 30 placas de Petri con un diámetro de 10 cm x 10 cm a 28 °C. El tiempo de germinación de la semilla de arroz es de aproximadamente 2 a 3 días y el tiempo de germinación de la semilla de cebada es de aproximadamente 2 días. La humedad relativa en el invernadero es de aproximadamente el 70%.
- Plante las plántulas de arroz o cebada en macetas con tierra para macetas y riego esterilizados en autoclave y luego cúbralas con una capa de vermiculita.
- Coloque las plantas en un invernadero o gabinete de crecimiento adecuado a 25 °C durante aproximadamente 1 ~ 2 semanas.
- Corta 3 capas de papel de filtro en círculos con tijeras quirúrgicas estériles (cada círculo debe tener un diámetro de 8 cm) y colócalas en placas de plástico estériles de 100 mm.
- Agregue ddH2O a cada plato para empapar el papel de filtro.
- Asegúrese de que el papel de filtro esté completamente mojado, pero no agregue agua adicional.
- Elimine el exceso de agua con una bomba de vacío.
- Coloque 2 palillos de dientes estériles en la placa de cultivo para sostener las hojas de arroz / cebada; separe los palillos de dientes a ~ 2 - 3 cm.
- Recoja las hojas del arroz 2 semanas después de sembrar las semillas o tome las hojas de la cebada 7 días después de sembrar las semillas.
- Usando plántulas de arroz / cebada de 4 a 6 hojas, corte la parte inferior del tallo a ~ 5 cm de la parte superior y recoja las hojas.
>3. Inoculación hiriente con cubos de micelio o gotitas de suspensión conidial de M. grisea
- Con una aguja anatómica, raspe tres heridas de 2 a 3 cm de largo en las venas principales de las hojas de arroz/cebada desprendidas; tenga cuidado de no penetrar en las hojas.
- Coloque las hojas raspadas en palillos de dientes y rocíe una solución Tween-20 al 0.02% (v/v) sobre las hojas para formar una capa de gotas.
- Corte un tapón micelial de 0,5 cm x 0,5 cm para cada cepa de M. grisea (cepas de tipo salvaje, mutantes, del complemento u otras cepas de prueba) de una placa OTA.
- Coloque los tapones miceliales o las gotas de 25 μL de suspensión conidial sobre las hojas heridas e incube las hojas a 25 °C en una cámara húmeda durante 3 a 8 días.
- Examinar las lesiones a los 5 - 7 días después de la inoculación. El método de examen es el mismo que para el método de inoculación por pulverización (véase el paso 1.3.13).
- Examine las hojas de arroz/cebada enfermas de ~6 cm de longitud y fotografíelas para evaluar la infección de las cepas analizadas. La infección se evaluó por el número de lesiones por 3,6cm2.
