1. Producción de VHB recombinante que codifica la proteína reportera
- Preparación de las células HepG2
- Prepare un medio de cultivo celular (medio de Eagle modificado de Dulbecco o DMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de aminoácidos no esenciales).
- Colocar 4 x 106 células HepG2 en una placa recubierta de colágeno de 10 cm en 10 ml de medio de cultivo el día antes de la transfección. Incubar las células HepG2 a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
nota: Cuando aproximadamente 4 x 106 células HepG2 se siembran en una placa recubierta de colágeno de 10 cm en 10 ml de medio de cultivo, tendrán una confluente del 70-90% al día siguiente.
- transfección
- Transfecte las células HepG2 con 5 μg de pUC1.2HBV (virus de la hepatitis B) delta epsilon y 5 μg de pUC1.2HBV/NL15 utilizando un reactivo de transfección según las instrucciones del fabricante.
- Al día siguiente, retire el medio de cultivo y agregue 10 ml de medio de cultivo fresco.
- Una semana después de la transfección, transfiera el medio de cultivo que contiene el VHB recombinante a un tubo de 50 ml y continúe con el paso 1.3.1. Añadir 10 ml de medio de cultivo fresco a la placa que contiene las células transfectadas.
nota: La producción del VHB recombinante se mantiene durante 4 semanas. El medio de cultivo que contiene VHB recombinante puede almacenarse a 4 °C durante 1 mes.
- Purificación del VHB recombinante
- Eliminar los restos celulares del medio de cultivo que contiene VHB recombinante mediante centrifugación (2.300 x g durante 5 min).
- Pase el sobrenadante a través de un filtro de membrana de 0,45 μm.
- Añadir un volumen igual de 26% de PEG/1,5 M de NaCl (polietilenglicol 6000: 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml de 0,5 M de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) pH 8,0 y 5 ml de 1 M HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico) (pH 7,6 en 500 ml) al medio de cultivo que contiene el VHB recombinante y mezclar suavemente. Incubar durante la noche a 4 °C.
- Centrifugar a 2.300 x g durante 20 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y disuelva el pellet en 0,5 ml de TNE (10 mM de Tris (tris(hidroximetil)aminometano), 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA).
- Retire los residuos por centrifugación a 2.300 x g durante 5 min.
- Cargue 0,5 ml de TNE que contiene VHB recombinante en 0,8 ml de sacarosa al 20% en TNE.
- Centrífuga a 100.000 × g durante 3 horas a 15 °C.
- Deseche la mayor cantidad posible del sobrenadante y guarde la bolita. Vuelva a suspenderlo en 1 ml de DMEM sin suero por cada 40 ml de medio de cultivo inicial.
- Incubar durante la noche a 4 °C.
- Filtre a través de un filtro de 0,45 μm. Preparar alícuotas de 0,5 ml y almacenar a -80 °C.
nota: Si se observa contaminación por proteína indicadora de la muestra original del virus, purifique el virus mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa al 5-30% en TNE a 100.000 x g durante 2 horas, o centrifugación equilibrada por densidad de CsCl de 1,1-1,6 g/ml a 150.000 x g durante 50 horas.
>2. Infección por VHB recombinante
- Cultivo de células HepG2 que expresan de forma estable NTCP (polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio) (HepG2/NTCP) que son susceptibles a la infección por VHB en DMEM suplementado con 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 250 μg/ml de G-418 (genética) y 100 U/ml de aminoácidos no esenciales a 37 °C en una incubadora humidificada de CO2 al 5%.
- Un día antes de la infección, coloque aproximadamente 5 x 104 células HepG2/NTCP en una placa recubierta de colágeno de 96 pocillos en 0,1 ml de medio de cultivo.
- Descongele el VHB recombinante en un baño de agua a 37 °C hasta que quede un poco de hielo en el vial.
- Prepare el medio para la infección combinando lo siguiente: 10 μl de PEG8000 al 40 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x, 2 μl de dimetilsulfóxido (DMSO), 10 μl de VHB recombinante y 78 μl de medio de cultivo fresco por pocillo de una placa de 96 pocillos.
- Agregue 100 μl de solución recombinante de VHB a un pocillo de la placa de 96 pocillos.
- Un día después de la infección, lavar las células infectadas 3 veces con 300 μl de PBS por pocillo para eliminar la proteína reportera contaminante de la fracción viral.
- Incubar las células infectadas en 200 μl de medio de cultivo que contenga 2% de DMSO durante una semana o menos.
3. Análisis
- Una semana después de la infección, lave las células infectadas 3 veces con PBS.
- Añadir 50 μl de tampón de lisis a las células infectadas.
- Agite la placa de cultivo durante 5 minutos y luego centrifugue a 2.000 x g durante 5 minutos.
- Añada 50 μl del sustrato indicador en la placa del luminómetro.
- Añadir 20 μl de lisado celular a una placa luminométrica que contenga el sustrato reportero. Mezclar por vórtice brevemente.
- Coloque la placa en el luminómetro e inicie la lectura.
