Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE
1. Soluciones requeridas
- Prepare 150 mg/L (para anestesia) o 300 mg/L (para eutanasia) de solución de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato (MS-222) con agua del acuario donde se mantienen los peces cebra. Llene un tanque pequeño con 1 L de solución anestésica y manténgalo aireado.
- Llene otro tanque pequeño con 1 L de agua de acuario sin MS-222 para la recuperación de los peces y manténgalo aireado.
- Prepare 50 ml de 1x PBS a partir de una solución madre estéril 10x.
- Para el análisis de citometría/aislamiento de células intestinales, prepare suficiente solución fresca de colagenasa tipo IV al 0,15% para 1 ml por pez a partir de una solución madre o de polvo en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) con penicilina y estreptomicina al 1% v/v (ver materiales). Hacer alícuotas (1 por pez) de 1 mL en tubos de centrífuga de 2 mL. Mantener a 4 °C hasta 30 minutos antes de la etapa de disección.
- Para microscopía confocal/fijación de muestras, prepare 50 mL de solución fresca de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS o descongele una solución madre de un congelador a -20 °C en una campana extractora.
cautela: El PFA es tóxico. Por favor, lea la hoja de datos de seguridad del material antes de trabajar con él. Se deben usar guantes y gafas de seguridad, y siempre dejar las soluciones dentro de una campana extractora.
>2. Preparación del equipo para la intubación oral
- Coloque aproximadamente 1 cm de un tubo de silicona fina en una aguja Luer lock de 31 G para cubrir la punta de la aguja.
- Corta la punta de una pipeta de filtro estéril de 10 μL (unos 2 cm), toma el extremo más fino y colócala sobre el tubo de silicona a modo de funda. Asegúrese de que la pipeta se extienda más allá de la punta de la aguja para evitar lesiones al animal.
- Conecte la aguja a una jeringa Luer lock de 100 μL.
nota: Siempre enjuague con etanol y luego con solución salina tamponada con fosfato (PBS, consulte Materiales) entre tratamientos.
>3. Preparación de la suspensión de nanopartículas fluorescentes
- Etiquete la nanopartícula de proteína con éster Atto-488 NHS (consulte la Tabla de materiales) o un tinte fluorescente apropiado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Vuelva a suspender las nanopartículas en un tampón de bicarbonato sódico de 0,1 M a una concentración de 2 mg/mL.
- Disuelva el éster Atto 488 NHS en dimetilsulfóxido (DMSO) libre de aminas a 2 mg/mL. Mantenga una alícuota de 10 μL para comprobar la eficiencia del etiquetado.
- Mezcle las nanopartículas y el éster Atto 488 NHS en una proporción molar de 1:2 (proteína: colorante) agitando en la oscuridad.
- Gire las nanopartículas marcadas por centrifugación a 8.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente, retire el sobrenadante y guárdelo para comprobar la eficiencia del etiquetado.
- Lave las nanopartículas marcadas resuspendiéndolas en 1 mL de tampón de bicarbonato de sodio 0,1 M mediante vórtice y pipeteo hacia arriba y hacia abajo. A continuación, deseche el sobrenadante por centrifugación a 8.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Repita el paso 3.6 5 veces.
- Vuelva a suspender el pellet en 5 mL de tampón de bicarbonato de sodio de 0,1 M en un tubo de centrífuga de 15 mL y haga alícuotas de la nanopartícula fluorescente en tubos de centrífuga de 1,5 mL (30 alícuotas). Centrifugar a 8.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y conservar a -80 °C protegido de la luz.
4. Anestesia e intubación oral del pez cebra
- Ayunar el pescado (>0,5 g) al menos 48 horas antes del experimento para vaciar el intestino.
- Mover los peces (12 peces) a los tanques experimentales (6 L) una noche antes del experimento para permitir la aclimatación12.
- Agite bien la solución de nanopartículas (por ejemplo, 2.500 rpm y 30 s) y extraiga el volumen deseado de suspensión de nanopartículas (por ejemplo, 20-50 μL) en la jeringa conectada a la aguja protegida.
- Coloque los peces en la solución aireada de 150 mg/L MS-222 (ver sección 1) hasta que se hundan hasta el fondo del tanque y no respondan a un pellizco de la aleta caudal; este proceso toma menos de 5 min.
- Transfiera rápidamente el pez anestesiado con una red a una bandeja de plástico húmeda, oriente al animal horizontalmente para que mire hacia la aguja e inicie inmediatamente la intubación oral.
- Sostenga cuidadosamente el pez con una mano y abra la boca con la otra mano con la aguja protegida. Inserte suavemente la aguja por el esófago hasta aproximadamente 1 cm de la abertura de la boca.
nota: El operador puede sentir una ligera resistencia cuando el extremo de la punta de la pipeta ha pasado por la branquia. Tenga cuidado de no inclinar demasiado la entrada de la aguja, lo que puede perforar la branquia.
- Inyecte lentamente la suspensión de nanopartículas en el pez. Asegúrese de que la suspensión no fluya hacia afuera a través de las branquias o la boca.
- Retire suavemente la aguja y coloque el pez en el tanque de recuperación (ver sección 1). La recuperación suele tardar 1 minuto.
- Revise el pescado cuidadosamente para detectar cualquier anomalía (por ejemplo, el sangrado en las branquias es un signo de perforación).
- Una vez que los peces se hayan recuperado, devuélvalos a los tanques experimentales.
